澳洲堅果油超聲波輔助提取工藝優化及其理化性質

涂行浩 孫麗群 唐景華 張明 帥希祥 陳洪 杜麗清

摘 ?要 ?為提高澳洲堅果油提取得率并獲得高品質油脂，采用超聲波輔助法提取澳洲堅果油，并分析提取油脂的理化性質。首先通過單因素實驗考察了提取溶劑、超聲功率、超聲時間以及液料比對提取率的影響，然后通過響應面法優化了提取工藝參數。結果表明，正己烷對澳洲堅果油提取率較高;適當增加超聲波功率、超聲時間以及溶劑量，澳洲堅果油得率均隨之增加;通過響應面優化，超聲波輔助提取澳洲堅果油的最佳提取條件為：液料比為9.6∶1（mL/g），超聲功率為520 W，超聲時間為32 min，澳洲堅果油得率達69.1%，2次提取總得率達96.3%。研究結果表明超聲波輔助提取是一種有效的油脂提取方法，從脂肪酸成分比例及理化性質來看，澳洲堅果油營養價值較高。

關鍵詞 ?澳洲堅果油;超聲輔助提取;響應面優化;理化性質

中圖分類號 ?TS225.1; TQ646 ? ? ?文獻標識碼 ?A

Abstract ?In order to improve the extraction rate of macadamia oil and obtain high quality oil， an ultrasonic assisted method was used to extract macadamia oil， and the physicochemical properties of the extracted oil were analyzed. The effects of extraction solvent， ultrasonic power， ultrasonic time and ratio of liquid to material on the extraction rate were investigated by single factor experiments， and then the extraction process parameters were optimized by response surface methodology （RSM）. The results showed that the extraction rate of macadamia oil was higher with n-hexane， and the yield of macadamia oil increased with the proper increase of ultrasonic power， ultrasonic time and solvent content. The optimum extraction conditions of macadamia oil were as follows： the ratio of liquid to material 9.6∶1 （mL/g）， the ultrasonic power 520 W， the ultrasonic time 32 min， and the yield of macadamia oil was 69.1% under the conditons. The total yield extracted twice reached 96.3%. The results showed that ultrasonic assisted extraction was an effective method for macadamia oil extraction. In terms of fatty acid composition and physicochemical properties， macadamia oil is a kind of natural vegetable oil with high nutritional value.

Keywords ?macadamia （Macadamia integrifolia） oil; ultrasound-assisted extraction; response surface optimization; physicochemical properties

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.017

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）又名夏威夷果，屬山龍眼科澳洲堅果屬[1]，原產于澳大利亞東海岸布里斯班地區的天然林中，中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所1979年首次從澳大利亞引進種植澳洲堅果，經過幾十年的發展，已在我國云南、廣西、廣東、四川以及貴州等邊遠貧困地區廣泛種植，截至2017年底，種植面積已達200萬公頃，占世界總種植面積的56%以上，位居世界第一，已成為世界上規模最大、最成功的種植區之一[2-3]。澳洲堅果果仁營養成分極其豐富，含油率高達70%～80%，且是唯一大量含有棕櫚油酸（palmitoleic acid，POA）的木本堅果[4-5];此外，其果仁還含有豐富的維生素E、甾醇和多酚等天然活性物質[6]。目前，澳洲堅果主要供鮮食，作為一種木本油料，國內外關于其油脂的研究和開發利用還較少[7-8]。

目前，傳統油脂提取工藝多采用機械壓榨法和溶劑浸出法。根據本課題組的前期研究表明，若不經高溫加熱壓榨澳洲堅果果仁，則產油率較低;而加熱壓榨，油脂得率雖有所改善，但堅果油色澤較深，過氧化值和酸值等指標上升明顯，活性物質損失嚴重，嚴重影響了堅果油這一高檔油脂的品質;另外，有機溶劑浸提法提取時間較長，不借助輔助手段提取率也不十分理想。而超聲波輔助提取油脂，可有效縮短提取時間，提高提取效率，在提取熱不穩定活性物質和要求低溫提取的天然油脂方面具有廣闊的應用前景，并能保證油脂的品質。目前已在核桃油、亞麻籽油以及枇杷仁油等特色油脂提取方面取得了較好的應用效果[9-11]。本研究針對傳統壓榨得油率低、油脂色澤不理想以及溶劑浸出時間長、溶劑使用量大等不足之處，采用超聲波強化溶劑浸出提取澳洲堅果仁油，希望能夠提高油脂提取率、縮短提取時間，以及減少萃取溶劑的用量，改善傳統油脂提取工藝的不足。目前，澳洲堅果油還未納入國家新資源食品目錄，也需要對澳洲堅果油的組分及理化性質進一步分析，以期對澳洲堅果油作為食用油脂的營養價值進行評價和展望，為澳洲堅果仁進一步研究和開發保健型食用油提供參考依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?澳洲堅果：由國家重要熱帶作物工程技術研究中心澳洲堅果研發部提供，品種為南亞1號。

1.1.2 ?試劑 ?石油醚（沸程60～90 ℃）、正己烷、無水乙醇、三氯甲烷、丙酮、冰乙酸、乙醚、酚酞、鹽酸、碘化鉀、可溶性淀粉、氫氧化鉀，國藥集團化學試劑有限公司;硫代硫酸鈉，天津市風船化學試劑有限公司。上述試劑均為分析純。

1.1.3 ?儀器與設備 ?JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;UV2700型紫外可見光分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司;YF3-1流水式中藥粉碎機，浙江永歷制藥機械有限公司;食品溫度計106型，Testo中國有限公司;ME-104精密型電子天平，Mettler Toledo中國有限公司;ST40高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司;HB-43快速水分測定儀，梅特勒-托利多上海公司;TY742X2A純水機，美國Barnstead公司;Hei-VAP Precision ML型旋轉蒸發儀，德國Heidolph集團;Thermo Science ITQ900氣相色譜質譜聯用儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司;892Rancimat專業油脂氧化穩定性分析儀，瑞士萬通中國有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?澳洲堅果仁組成成分測定 ?水分及揮發物參照GB/T 5528-2008方法測定;粗脂肪參照GB/T 14772-2008方法測定;粗蛋白參照GB/T 14489.2- 2008方法測定。

1.2.2 ?超聲波提取工藝流程 ?澳洲堅果仁→破殼取仁→粉碎混勻→稱重→溶劑混勻→超聲提取→離心取上清液→旋轉蒸發→澳洲堅果毛油

1.2.3 ?提取溶劑的篩選 ?選用無水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷以及三氯甲烷分別提取澳洲堅果果仁中的油脂，操作參數為：準確稱量已破碎的澳洲堅果仁10.00 g，液料比為10∶1（mL/g），提取時間30 min，超聲波功率500 W，然后在8000 r/min條件下離心15 min，取上清液，采用旋轉蒸發儀進行溶劑蒸發，將得到的濃縮物置真空干燥箱中烘干至恒重，對得到澳洲堅果油稱重，以澳洲堅果油提取率為評價指標，來確定合適的提取溶劑。

提取率=

1.2.4 ?超聲波提取澳洲堅果油的單因素試驗 ?（1）超聲波功率對提取率的影響。液料比10∶1（mL/g），超聲時間為30 min，設置超聲波功率分別為200、300、400、500、600 W，考察不同超聲功率對堅果油提取得率的影響。

（2）超聲時間對提取率的影響。液料比10∶1（mL/g），超聲功率500 W，設置超聲提取時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min，考察不同提取時間對堅果油提取率的影響。

（3）液料比對提取率的影響。超聲功率500 W，超聲時間30 min，設置液料比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL/g），考察料液比對堅果油提取率的影響。

1.2.5 ?響應面法優化提取工藝 ?在單因素實驗基礎上，利用Design Expert 7.1.3軟件程序，根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，設計3因素3水平的響應面實驗，以影響澳洲堅果油提取率的3個主要因素超聲功率（A）、提取時間（B）和液料比（C）為響應變量，澳洲堅果油提取率Y為響應值進行工藝優化，實驗因素水平設計見表1所示。

1.2.6 ?提取級數的確定 ?稱取粉碎后的澳洲堅果仁10.00 g，以優化后的最佳工藝條件進行提取，共提取n次，將每次的油脂分別進行稱重，計算

每次的油脂提取率，將n次提取的油脂提取率總和視為1，最佳提取級數的確定以累計油脂提取總得率≥95%為準，液料比為10∶1（mL/g）。

1.2.7 ?澳洲堅果油脂肪酸分析 ?脂肪酸的測定參照GB 5009.168-2016并作適當修改，澳洲堅果油加入碳十七脂肪酸甲酯作為內標，采用5%濃硫酸-甲醇溶液進行甲酯化處理，分析使用HP-FFAP色譜柱，進樣口溫度260 ℃，分流比10∶1，檢測器溫度280 ℃，色譜柱初溫210 ℃，保持8 min，程序升溫20 ℃/min，升至230 ℃，并在此溫度下維持6 min。

1.2.8 ?澳洲堅果油理化指標測定 ?根據相應的國家標準，檢測超聲波輔助提取的澳洲堅果油的理化指標，分析油脂品質。相對密度（20 ℃）：GB/T 5518-2008;酸值（mg/g）：GB/T 5530-2005;碘值（g/100 g）：GB/T 5532-2008;皂化值（mg/g）：GB/T 5534-2008;過氧化值（mmol/kg）：GB/T 5538-2005。

1.3 ?數據處理

每個實驗重復3次，結果表示為平均值±標準偏差。采用Design Expert 7.1.3軟件進行響應面的設計與分析，采用Excel軟件以及Origin 8.0軟件繪圖，統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行。

2 ?結果與分析

2.1 ?澳洲堅果仁組成成分測定結果

通過表2可知，澳洲堅果果仁營養豐富，其中含量最高的營養成分是粗脂肪，含量高達（73.69±1.21）%;粗蛋白含量也較為豐富，達到（8.96±0.47）%;另外，含有少量的總糖和可溶性淀粉。澳洲堅果果仁的成熟過程中，糖類等物質逐漸轉化為油脂，而判定澳洲堅果質量以及分級的一個主要指標是含油量，優質果仁含油率高一些，農業行業標準NY/T 693-2003規定澳洲堅果A級果仁的含油率需達到72%以上，可見本研究選用的材料達到了A級果仁的要求。

2.2 ?不同溶劑對澳洲堅果油提取率的影響

油脂的提取溶劑有多種，不同溶劑對脂肪酸溶解性不同，得率也不同，不同溶劑對其他功能性油脂的影響已有多篇文章報道[12-13]，而堅果油的提取溶劑各種文獻報道中也不盡相同，因此，有必要了解不同溶劑對堅果油提取率的影響。本研究使用不同溶劑對澳洲堅果油進行了萃取，結果見圖1。從圖1可知，正己烷對堅果油的一次提取率最高，而乙醚、95%乙醇的一次提取率相對較低;不同提取溶劑對提取率的影響差異顯著（P<0.05）。提取溶劑中乙醚、丙酮、三氯甲烷等溶劑具有一定毒性，溶劑可能殘留于提取油脂中，會危害人體健康;而石油醚屬于易燃易爆溶劑，不適用于工業化提取油脂;目前，國內外工業中提取油脂的常用溶劑也是正己烷。所以本研究選用正己烷作為提取澳洲堅果油的溶劑[7]。

2.3 ?超聲功率對提取得率的影響

不同超聲波提取功率對堅果油提取率的影響如圖2所示。從圖2可以看出，超聲波功率在200～500 W范圍內時，堅果油提取率隨著功率的增大呈現逐漸上升趨勢，不同超聲功率對提取率影響極顯著（P<0.01），這是因為超聲波功率增加使超聲波效應增強，產生的空化效應使澳洲堅果組織細胞更容易破裂，進而使油脂組分更容易從細胞中釋放出來。當功率達到500 W左右時，提取率達到相對最大值;但功率超過500 W，提取率隨著功率的增大反而有一定程度的下降，高功率條件下，空化作用不僅破碎細胞壁，可能也破壞了欲提取物質的分子結構[14]。因此，本實驗條件下選擇超聲功率為500 W左右為優化水平進行響應面優化。

2.4 ?超聲時間對澳洲堅果油提取效果的影響

超聲提取時間對澳洲堅果油提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，提取率隨著超聲時間的延長而增加，并在30 min時達到相對最大的提取率;而當超聲時間超過35 min時，提取率有所降低，但基本保持持平，不同超聲時間對提取率的影響差異顯著（P<0.05）。可見超聲提取時間越長，堅果果仁中的油脂提取越完全，但超聲時間超過30 min后，提取率升高不明顯，這可能是由于超聲時間過長，導致超聲容器內溫度上升，可能引起油脂發生一定程度的分解反應所致[15]。因此，選擇超聲提取時間為30 min左右為優化水平進行響應面優化。

2.5 ?液料比對澳洲堅果油提取率的影響

液料比的變化對澳洲堅果油提取率的影響如圖4所示。從圖4中可看出，隨著液料比的增大，澳洲堅果油提取率有明顯的提高，不同料液比對提取率的影響差異顯著（P<0.05）。在液料比為12∶1（mL/g）時達到較大值，再增加液料比，堅果油提取率反而增加不明顯，這是因為對于一定質量的澳洲堅果仁來說，溶劑使用量的增加，會降低提取溶劑中澳洲堅果仁油的濃度，增加了物料與溶劑接觸界面處的濃度差，從而提高了傳質速率，在一定時間內提取率增大[16]。當溶劑用量達到一定值后，如本實驗中達到12∶1（mL/g）時，由于澳洲堅果仁中的油脂大部分已被提取，再增加溶劑使用量，提取率沒有明顯提高。從經濟方面考慮，選擇液料比為12∶1（mL/g）左右為優化水平進行響應面優化。

2.6 ?超聲波輔助提取澳洲堅果油工藝條件的優化

結合單因素實驗結果，利用Design-Expert 7.1.3軟件，按Box-Benhnken實驗設計原理進行3因素3水平實驗，以澳洲堅果油提取率為響應值，優化超聲波輔助提取澳洲堅果油的工藝參數條件。響應面分析方案及結果見表3。

以超聲功率、超聲時間以及液料比為響應變量，以油脂得率（Y）為響應值，采用Design Expert 7.1.3軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，所得到的方程為：

從表4方差分析結果可知，模型P<0.0001，表明回歸模型極顯著，因變量與所有自變量之間的線性關系顯著（R2=0.9880）。失擬項P=0.1205> 0.05，模型失擬度不顯著。模型的調整確定系數RAdj2=0.9726，說明該模型擬合程度良好，實驗誤差小;結合表3數據，實測值與預測值之間也具有較好的擬合度，可用此模型來分析和預測超聲提取澳洲堅果油的工藝結果。由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，模型中超聲功率A對澳洲堅果油提取率的影響極其顯著，液料比C對澳洲堅果油提取率的影響顯著，另外從表4回歸方程系數檢驗的P值可以看出各因素的改變對響應值的影響并不是簡單的線性關系，而是存在交互作用的影響。在所選的各因素水平范圍內，結合F值的大小，可知影響超聲提取澳洲堅果油的因素主次順序為：超聲功率>液料比>超聲時間。

根據回歸方程做出模型的響應面及其等高線見圖5、圖6、圖7所示。響應面圖是響應值Y對實驗中各影響因素所構成的三維空間圖，從圖中可以非常直觀地看出最佳影響因素與各因素之間的交互作用;等高線的形狀可以反映出交互作用的顯著性，圓形表明2個因素之間交互作用不明顯，而橢圓形表示2個因素之間交互作用顯著[11]。

本研究主要以油脂提取率為響應指標，討論超聲輔助提取的最佳制備工藝條件，利用Design-expert 7.1.3軟件對實驗結果進行優化，得到最佳工藝條件并在圓整條件下進行驗證。由圖5、圖6、圖7可知，各因素中以超聲功率對澳洲堅果油提取率影響最大，其次是料液比，超聲提取時間的影響最小。另外，對澳洲堅果油提取率影響顯著的因素，表現為曲線較陡，響應值變化較大;對澳洲堅果油提取率影響不顯著的因素，響應曲面較為平滑，響應值變化較小[13]。可以看出超聲功率和料液比對澳洲堅果油提取率有非常明顯的交互影響作用，即澳洲堅果油提取率在較高超聲強度以及較大的料液比處理下提取率顯著上升，如在超聲功率為600 W，料液比為14∶1（mL/g），超聲時間為30 min時，堅果油提取率達到65.8%。

根據所建立的數學模型進行參數最佳化分析，得到最優提取條件為：液料比為9.58∶1（mL/g），超聲波時間為32.01 min，超聲波功率為523 W，預測提取率為69.5%。為進一步驗證響應面分析法所建立的數學模型的顯著性，有必要對推斷方案進行實驗。采用上述條件且取整數，即液料比為9.6∶1（mL/g），超聲功率520 W，超聲時間為32 min，進行3次重復驗證實驗，測得提取率為69.1%，與理論預測值相比，相對誤差為0.58%左右，因此采用響應面分析法優化得到的提取條件參數準確可靠，具有實用參考價值。

2.7 ?超聲輔助提取工藝提取級數的確定

澳洲堅果油的提取級數見圖8所示。由圖8可知，前2次的澳洲堅果含量已占5次提取總含量的96.3%，再增加提取次數含量上升不明顯，這可能是因為部分油脂以結合態的形式存在于細胞中，即使劇烈提取條件也很難再被溶出，出于經濟角度考慮，提取級數定為2級即可將果仁油脂提取完全。

2.8 ?澳洲堅果油中脂肪酸含量檢測結果

由表5及圖9可知，澳洲堅果油中主要含有油酸（60.50%）、棕櫚油酸（18.98%）、棕櫚酸（8.89%）等，其中單不飽和脂肪酸含量占了總量的82.06%以上。單不飽和脂肪酸具有特殊的生理功能和獨特的物理、化學特性，尤其是澳洲堅果油富含的單不飽和脂肪酸棕櫚油酸，是最具代表性的Omega-7脂肪酸，其在營養、醫藥乃至工業上都具有非常重要的應用價值。棕櫚油酸在一般油料作物中含量較少，但在一些特殊植物中也有很高的含量，因此尋找植物性來源并加以提取可以較好的彌補其產量的不足。Omega-7棕櫚油酸常見于深海魚油（如鳳尾魚）和某些植物油（澳洲堅果油，沙棘油，海藻油等）中，但深海魚油中Omega-7棕櫚油酸含量相對偏低，高濃度的Omega-7需要通過特殊純化工藝提取獲得[17]。目前市面上Omega-7棕櫚油酸幾乎都是從一些天然植物（例如沙棘果和澳洲堅果）中獲得[18]。不同于深海魚類等動物資源，植物資源是可持續的。可持續的種植澳洲堅果、沙棘果等也能夠產出質量更好的Omega-7產品，并且可以使用傳統有機的種植模式。而大田栽培的油料作物種子僅含微量（一般含量<2%）的Omega-7脂肪酸，難以滿足人類食用和工業的需求。一方面，沙棘果雖然含較高的棕櫚油酸，但同時含有較多的飽和脂肪酸——棕櫚酸（約30%），油脂中較高的棕櫚酸含量通常認為會對健康不利，而澳洲堅果油棕櫚酸的含量相對較低（8.89%）;另一方面，沙棘油特殊的氣味不被部分人群所接受，而澳洲堅果油含有獨特的清香，產量更高，種植范圍相對較廣，豐產期有40～60 a，更具有廣泛用于獲取Omega-7脂肪酸并應用于食品工業的前景[19]。另外，研究表明食用澳洲堅果油，對降低人體血壓、降低血清膽固醇有明顯療效，對防止動脈粥樣硬化、冠狀動脈硬化和血栓的形成也有著積極的作用，這與澳洲堅果油獨特的脂肪酸組成也具有一定的關系[20-21]。

2.9 ?澳洲堅果油理化性質分析

澳洲堅果與核桃均是含油率較高的樹生堅果，且近幾年在國內休閑食品領域消費數量日益增加。2016—2017堅果炒貨單品中國電商銷售統計排名中，澳洲堅果排名第二，僅次于核桃。核桃油目前已有國家標準，而澳洲堅果還沒有制定相關品質標準，因此，本研究將超聲波提取的澳洲堅果油與核桃油理化指標進行了對比分析，具體對比指標見表6。由表6的測定結果可知，超聲波法提取澳洲堅果油脂品質較高，其中酸值、過氧化值2個反映油脂質量的指標達到浸出核桃油一級指標值，符合優質食用油標準;澳洲堅果油的碘值較核桃油偏低，而碘值反映了油脂中不飽和脂肪酸的雙鍵量[22]，這與澳洲堅果油主要由單不飽和脂肪酸組成，而核桃油多不飽和脂肪酸含量較高有關，這與葉麗君等[23]、張玲等[24]以及Moodley等[25]的研究結果相符，表明澳洲堅果油是一種不干性油。一般來說，富含多不飽和脂肪酸的油脂也更容易氧化，因此，含有更多單不飽和脂肪酸的澳洲堅果油比核桃油更耐貯藏，這與葉麗君等[23]研究的澳洲堅果油的氧化誘導期比特級初榨橄欖油高，甚至是菜籽油以及大豆油的5倍結果相符。

3 ?討論

在本研究的實驗條件范圍內，通過響應面方法建立并驗證的回歸模型準確有效，可用來分析和預測設定條件范圍內及其附近的超聲提取澳洲堅果油的工藝結果，且結果可靠性較高。最優超聲提取條件下，澳洲堅果油得率達到69.1%，經過2次提取澳洲堅果油總得率達到96.3%。相比常規壓榨法以及溶劑提取法，超聲輔助提取不但減少了溶劑的用量，而且大大縮短了提取時間。本研究中的澳洲堅果果仁中的油脂基本上被提取完全，提取效率更高，而且堅果果粕中殘留油脂更少，理化性質分析結果表明本研究提取的澳洲堅果油符合優質食用油的標準，甚至超過了國家標準中浸出核桃油的一級標準。從本研究提取的澳洲堅果油的脂肪酸組成及理化性質可知，澳洲堅果油是一種營養豐富的功能性油脂，另外，多不飽和脂肪酸已經證明對人體有重要的生理功能，單不飽和脂肪酸特殊的生理功能和獨特的物理、化學特性還有待進一步挖掘。從本研究結果看，我們需要對澳洲堅果油中的單不飽和脂肪酸足夠重視，例如本研究中提取的澳洲堅果油中典型的單不飽和脂肪酸油酸（C18∶1）以及棕櫚油酸（C16∶1）2種單不飽和脂肪酸約占脂肪酸總量的80%，尤其是棕櫚油酸（又稱Omega-7）含量較高，具有廣泛用于獲取Omega-7脂肪酸并應用于食品工業的前景，而棕櫚油酸又是一種非常昂貴的單不飽和脂肪酸，高純度的Omega-7市場價能達到每克200多元，堪比黃金。鑒于Omega-7脂肪酸在人類健康、醫藥上的獨特價值以及可作為再生資源的重要性，因此我們有必要在借鑒國外已有研究成果的同時，根據我國植物資源和人群健康狀況，加快我國開展Omega-7脂肪酸的科學研究和產品開發，可進一步發掘其營養價值，為我國澳洲堅果的綜合開發利用提供新的思路和方法。

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