可可種質資源抗寒性初步評價及低溫脅迫下生理響應

李付鵬 伍寶朵 秦曉威 閆林 賴劍雄

摘 ?要 ?本研究以收集保存的38份可可種質資源為對象，在2016年1月極端低溫期間，進行抗寒性初步評價，依據低溫危害后可可果實和葉片損害程度，可可資源抗寒性可分成5級。以具有抗寒性差異的INA-t5（Ⅰ級）、COM-e8（Ⅱ級）、ECU-ev6（Ⅳ級）、THA-o6（V級）種質為材料，研究抗寒性差異種質在4 ℃脅迫條件下植株的傷害情況、葉片解剖結構和生理生化指標變化。結果表明：低溫脅迫條件下，INA-t5、COM-e8種質比THA-o6、ECU-ev6種質具有明顯的耐寒表型，可可葉片受害程度差異顯著;可可的丙二醛和脯氨酸含量的變化幅度與其抗寒性呈現負相關;脅迫48 h 后，THA-o6、ECU-ev6種質保護酶系統逐漸被破壞，INA-t5、COM-e8種質則仍然表現活躍。綜合以上結果，INA-t5、COM-e8為抗寒性種質，其抗寒性比THA-o6、ECU-ev6強，抗氧化酶活性和滲透物質含量變化規律以及差異種質，可為可可開展抗寒育種和抗寒分子機理研究提供理論和材料基礎。

關鍵詞 ?可可種質;鑒定評價;抗寒性;酶活性

中圖分類號 ?S571.3 ? ? ?文獻標識碼 ?A

Abstract ?During the extreme low temperature period of January 2016， cold resistance of 38 cacao germplasms were evaluated in Wanning， Hainan. According to the damage degree of cacao pods and leaves after low temperature， five grades were distinguished among the cacao germplasms. Using the selected cold resistance difference germplasms INA-t5 （grade Ⅰ）， COM-e8 （grade Ⅱ）， ECU-ev6 （grade Ⅳ） and THA-o6 （grade V）， leaves anatomy and physiological responses of the cacao plants were studied after 4 ℃ low temperature treatment. Under low temperature stress， INA-t5 and COM-e8 showed obvious cold-tolerance over THA-o6 and ECU-ev6， and the damage degree of the leaves was significant. It was negatively correlated between cold resistance and malondialdehyde， proline content in cacao leaves. The protective enzyme systems of THA-o6 and ECU-ev6 were gradually destroyed in low temperature stress for 48 h， while the enzyme system of INA-t5 and COM-e8 were still active. It meant that the cold resistance of INA-t5 and COM-e8 was stronger than that of THA-o6 and ECU-ev6. The antioxidant enzyme activity， osmotic substances content and cold-resistance difference germplasm could be used for cold-resistant breeding and molecular mechanism investigation.

Keywords ?cacao germplasm; identification and evaluation; cold resistance; enzyme activity

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.006

可可（Theobroma cacao L.）屬于梧桐科可可屬常綠小喬木，種子（可可豆）富含脂肪、蛋白、多酚等成分，味醇香，是制作巧克力、飲料等的主要原料。可可原產南美熱帶雨林下，是典型的熱帶作物，現已廣泛分布于世界熱帶地區的60多個國家，直接從業者超過4000多萬人[1]。據國際可可組織（ICCO）統計，2016和2017年收獲季世界可可收獲面積約1000萬hm2，總產量470萬t，為世界第二大飲料作物[2-3]。我國可可主要種植在海南、云南，國內生產的可可豆遠不能滿足市場需求，目前我國所需可可豆基本依賴進口，2017年我國可可豆及制品進口量為12萬t，且每年以較快的增長率持續遞增。歐美等發達國家人均巧克力年消費在10 kg以上，即使在亞洲，東亞大多數國家的人均年消費也在2 kg以上，而目前我國還不足50 g[4-5]。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結構的變化，可可消費量還將大幅增加，市場缺口不斷擴大。

我國可可主要分布在海南、云南、廣東、臺灣等省區，其中海南是可可主產區，種植面積和產量均占全國90%以上[6]。我國海南地處熱帶邊緣，可可主產區冬季常有低溫危害，主栽品種熱引4號可可受寒后易出現落葉、落果、枯枝等現象，且傷口極易感染黑果病等病害，易給種植戶造成嚴重經濟損失[7]。低溫成為影響我國可可豐產穩產和制約可可產業北擴的重要因素。因此開展可可種質資源抗寒性鑒定，篩選和培育抗性種質（品種）是我國可可育種的重要目標。

中國熱帶農業科學院香料飲料研究所從20世紀60年代開始，從東南亞、非洲、拉丁美洲等可可主產區收集3大類可可遺傳資源300多份，含有許多具有經濟開發潛力的優異資源，為可可品種選育和改良提供了重要材料來源[8]。然而，關于可可種質資源抗寒性鑒定，低溫脅迫對可可幼苗生理生化的影響仍未見報道。本研究利用極端低溫天氣對收集保存的可可種質資源進行抗寒性鑒定，篩選抗寒性強的可可種質，并對篩選出的抗寒性差異種質開展葉片生理生化和顯微結構變化研究，為進一步研究可可抗寒機理提供依據，并為可可抗寒育種研究提供優異材料資源。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料來自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所農業農村部熱帶香料飲料作物種質資源圃的38份可可資源，厄瓜多爾8份（ECU-）、巴新1份（PNG-）、印尼6份（INA-）、科摩羅2份（COM-）、越南4份（VN-）、泰國5份（THA-）、名稱中有“SBRI-”的12份種質為在引進種質基礎上雜交創制的資源，詳見表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?成齡可可樹抗寒性田間調查 ?2016年1月23日極端低溫后，田間調查38份可可資源材料的抗寒性，為便于比較分析，將可可抗寒性程度分成5級，標準如下：

Ⅰ級：果實生長正常，≤10%成熟葉片葉色黃色;Ⅱ級：1/8果實表面顏色出現黑色果實比例> 30%（果實寒害1級），成熟葉片葉色黃色比例> 10%、≤30%;Ⅲ級：1/4果實表面顏色出現黑色果實比例>30%（果實寒害2級），成熟葉片葉色黃色比例>30%、≤50%;Ⅳ級：1/2果實表面顏色出現黑色果實比例>30%（果實寒害3級），成熟葉片葉色黃色比例>50%、≤70%;Ⅴ級：3/4果實表面顏色出現黑色果實比例>30%（果實寒害4級），成熟葉片葉色黃色比例>70%。

1.2.2 ?可可幼苗低溫脅迫處理 ?篩選抗寒性差異的8份可可種質，分別繁育袋裝苗，選取無病蟲害、長勢良好、生長一致的可可袋裝苗在光照培養箱中進行低溫脅迫處理，試驗溫度處理設置為4 ℃，試驗對照溫度設置為30 ℃/28 ℃，光周期設置為12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。低溫脅迫0、24、48、72、96 h時，分別剪取葉片并迅速置于液氮中冷凍，–80 ℃保存，用于后續測定葉片生理生化指標變化;剪取第一穩定葉，并用FAA固定液處理后，制作石蠟切片觀察葉片解剖結構，每個處理重復3次。

1.2.3 ?生理指標測定 ?可可生理生化指標采用江蘇科銘生物技術有限公司測定試劑盒，參照試劑盒操作說明進行測定INA-t5、COM-e8、ECU-ev6、THA-o6 4份可可種質幼苗葉片的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量（Pro）、丙二醛含

量（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性等生理生化指標。從無病害、成熟葉中部剪取樣品，大小為5 mm×5 mm，將樣品置于FAA固定液處理72 h，經石蠟切片機切片、染色后，置于Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察拍照，比較各樣品柵欄組織和海綿組織結構變化。

1.3 ?數據處理

觀測數據取3次重復的均值，用Excel軟件處理分析數據，采用Duncan新復極差法進行多重比較，分別在0.05和0.01水平比較差異顯著性。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同可可種質抗寒性表現

2016年1月，海南萬寧興隆地區極端低溫達7 ℃條件下，農業農村部熱帶香料飲料作物種質資源圃的38份可可種質葉片、果實凍害率及綜合抗寒等級見表1，果實受寒害后表現如圖1。由表1看出，供試材料的抗寒性分為5級，從強到弱分別包含3、22、10、2、1份種質，耐寒與極不

耐寒種質份數均呈現低比例趨勢。其中VN-sv6、INA-t5種質田間抗寒性最強，葉片受害率分別為15.9%、15.6%，1級抗寒等級果實比例分別為9.1%、9.8%。THA-o6種質田間抗寒性最弱，葉片受害率為70.5%，4級抗寒等級果實比例為62.2%。此外，COM-e8種質葉片受害率為33.8%，1級抗寒等級果實比例為33.6%;ECU-ev6種質葉片受害率為59.7%，3級抗寒等級果實比例為36.9%。

2.2 ?低溫脅迫對可可葉片結構影響

4 ℃低溫脅迫處理后，可可種質INA-t5、THA-o6葉片表型及顯微結構變化見圖2和圖3。結果表明，隨著低溫脅迫時間延長，THA-o6葉片的葉脈及附近組織逐漸褐化，脅迫24 h主葉脈開始出現褐化，脅迫48 h主葉脈和支葉脈褐化，脅迫72 h主葉脈和支葉脈全部褐化并向附近組織擴散，脅迫96 h主葉脈和支葉脈全部褐化，葉脈間大部分葉肉組織褐化并出現失水現象。INA-t5葉片在低溫脅迫前期變化不明顯，脅迫96 h主葉脈表現出輕度褐化。THA-o6葉片4 ℃脅迫96 h后，海綿組織細胞排列紊亂，并且微葉脈細胞著色較深;INA-t5葉片4 ℃脅迫96 h后變化不明顯，部分微葉脈細胞著色較深。

2.3 ?低溫脅迫對可可葉片可溶性糖含量、可溶性蛋白影響

4 ℃低溫脅迫后，不同可可種質可溶性糖含量、可溶性蛋白隨脅迫時間延長出現顯著變化（圖4）。INA-t5種質的可溶性糖含量呈升高趨勢，脅迫96 h時達到最大值，與相比脅迫0 h相比提高了1.31倍;可溶性蛋白先下降再上升后保持穩定，脅迫24 h時達到最小值，降低到脅迫0 h的0.63倍，脅迫48 h時回升1.37倍，脅迫96 h含量達到最高，顯著高于其他種質。COM-e8種質的可溶性糖含量呈先穩定再下降后回升變化趨勢，可溶性蛋白呈下降、上升式變化，脅迫72 h時達到最小值，降低到脅迫0 h的0.43倍，脅迫96 h時回升1.65倍。THA-o6、ECU-ev6可溶性糖含量呈現下降趨勢，脅迫72 h時略有上升;可溶性蛋白呈下降、上升、下降波浪式變化，脅迫24 h時達到最小值，分別降低到脅迫0 h的0.57、0.47倍，隨后升高后再降低，脅迫96 h時與脅迫0 h相比降低了0.42、0.33倍。脅迫96 h后，抗寒種質INA-t5可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著高于其他3份種質。說明低溫脅迫后，可可響應低溫，提高可溶性糖和可溶性蛋白含量以提高對膜的保護作用，然而對低溫響應能力不強。

2.4 ?低溫脅迫對可可葉片Pro、MDA含量影響

4 ℃低溫脅迫后，不同可可種質脯氨酸、丙二醛變化差異較大（圖5）。低溫脅迫后，INA-t5、COM-e8的Pro含量變化不大;ECU-ev6的Pro含量先上升后下降，脅迫24 h時達到最大值，與脅迫0 h相比提高了4.57倍，隨后急劇下降脅迫48 h時僅為脅迫24 h時的0.28倍;THA-o6的Pro含量呈上升、下降、上升波浪式變化，脅迫24、48、72 h時，含量分別為脅迫0 h的1.85倍、1.10倍、2.37倍。INA-t5的MDA含量持續上升，脅迫72 h時達到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.65倍;COM-e8的MDA含量先上升后下降，脅迫24 h時達到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.31倍;THA-o6、ECU-ev6的MDA含量下降后略有回升。4 ℃低溫脅迫后，THA-o6、ECU-ev6的MDA、Pro變化幅度較大，膜脂過氧化程度較高導致抗寒性弱;INA-t5、COM-e8的MDA、Pro含量變幅小，膜脂過氧化程度較低從而抗寒性強。

2.5 ?低溫脅迫對可可葉片POD、CAT、SOD 活性影響

4 ℃低溫脅迫處理對可可POD、CAT、SOD活性的影響見圖6。由圖3可以看出，4 ℃低溫脅迫后，INA-t5 POD酶活性先上升后下降，脅迫24 h時達到最大值，顯著高于其他3份種質;THA-o6 POD酶活性變化不明顯，脅迫24 h時達到最小值，降低到脅迫0 h的0.94倍，隨后少量回升并保持穩定，并且顯著低于INA-t5和ECU-ev6種質。INA-t5 CAT酶活性呈上升趨勢，脅迫96 h時達到最大值，與脅迫0 h相比提高了2.88倍，顯著高于其他3份種質;THA-o6、COM-e8 CAT酶活性呈持續下降趨勢，脅迫96 h時達到最小值，分別降低到脅迫0 h的0.27、0.28倍。INA-t5、COM-e8比THA-o6、ECU-ev6 SOD酶活性高，分別呈現波浪變化，INA-t5脅迫48 h時達到最小值降低到脅迫0 h的0.86倍，脅迫72 h時回升到最大值降低為脅迫0 h的1.06倍;THA-o6 SOD酶活性先降低再回升然后持續降低，脅迫48 h時回升到脅迫0 h的1.01倍，脅迫96 h時降低到脅迫0 h的0.38倍。以上結果說明，4 ℃低溫脅迫后THA-o6、ECU-ev6 CAT、SOD、POD酶活性偏向下降趨勢或維持較低水平，而INA-t5、COM-e8 CAT、POD、SOD酶活性偏向上升趨勢或維持較高水平。

3 ?討論

植物體內可溶性糖含量、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛含量與植物低溫等逆境生理密切相關[9-10]。在逆境脅迫下，植物細胞通過調節可溶性糖和可溶性蛋白的含量，改變細胞質濃度和細胞保水力能力，緩解細胞質過度脫水，起到保護細胞質使其不致遇冷結冰[11]。在許多植物中，可溶性糖與蛋白含量與抗寒性呈現正相關，可能是由于植物體內糖與蛋白質合成增加或降解減少[12]。油棕、油橄欖等植物的可溶性糖與蛋白含量隨低溫脅迫程度的增強呈上升趨勢，抗寒性強的品種上升的幅度越大[13-14]。本研究表明，低溫脅迫后可可的可溶性糖和可溶性蛋白都表現含量變化多樣，抗寒鑒定較強的種質INA-t5可溶性糖含量呈現上升趨勢，ECU-ev6、THA-o6、COM-e8可溶性糖含量呈現下降趨勢;測試的4份種質可溶性蛋白蛋白含量經低溫脅迫后，均出現下降隨后表現出少量回升。可能因為可可是熱帶作物，在初次經歷極端低溫時體內可溶性糖與蛋白質進行代謝供能導致含量下降，隨著低溫脅迫時間延長植株對外界不良環境做出應激反應，可溶性糖和蛋白含量上升，隨著低溫脅迫持續，細胞受損結構被破壞，植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量又呈現降低趨勢。

在逆境脅迫下，游離脯氨酸、丙二醛可作為滲透調節物質和防脫水劑，通過提高細胞內滲透物濃度而降低水勢，使細胞保持膨壓，當植物受到環境脅迫時會使植物體內游離脯氨酸和丙二醛的含量迅速積累[15-17]。本研究中，從植株表型判定，INA-t5抗寒性較強，ECU-ev6、THA-o6抗寒性弱;4 ℃低溫脅迫后，ECU-ev6、THA-o6和COM-e8脯氨酸含量先上升后下降，而INA-t5的脯氨酸含量略有上升;ECU-ev6、THA-o6和COM-e8丙二醛含量先下降后上升，INA-t5的丙二醛含量緩步上升。結果表明可可的脯氨酸和丙二醛含量與其抗寒性呈現負相關，低溫脅迫后抗寒性強的可可種質脯氨酸和丙二醛含量變化不明顯，抗寒性弱的可可種質脯氨酸和丙二醛含量波動幅度較為顯著。

在植物體內，SOD酶催化底物發生歧化反應生成H2O2，以清除超氧自由基的解毒作用，POD與SOD功能相似，清除細胞內活性氧自由基，防止膜脂質過氧化損傷[18-20]; 低溫脅迫下，植物SOD活性一般先升后降[21-23]。4 ℃處理后，INA-t5和COM-e8種質中SOD酶活性呈現先升后降趨勢，表明低溫處理條件下，低溫誘使可可SOD酶活性上升，隨低溫脅迫時間持續，可可植株體內積累了大量的活性氧，導致活性氧和防御系統的動態平衡被打破，進而加劇膜脂的過氧化反應。4 ℃低溫脅迫下，THA-o6種質CAT和POD活性都呈現先升后降的趨勢，INA-t5種質CAT活性表現持續上升的趨勢，說明隨脅迫時間延長，THA-o6種質保護酶系統已經被破壞，INA-t5防御系統仍然發揮作用。

低溫脅迫后，可可的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量和丙二醛，SOD、POD和CAT活性，都會出現顯著性變化。可溶性糖和可溶性蛋白呈現波動變化趨勢，丙二醛和脯氨酸含量增幅不明顯，抗寒性強的種質抗氧化酶活性能夠持續活躍。在低溫誘導條件下，抗寒性弱的可可種質可溶性蛋白、脯氨酸含量、丙二醛和抗氧化酶活性均出現顯著波動，隨著低溫脅迫持續進行，導致細胞結構破壞，植株的抗氧化酶系統和代謝活動失效，植株抗寒性表現出明顯降低趨勢。本研究得出的滲透物質含量和抗氧化酶活性變化應答規律，以及鑒定出的抗寒性差異可可種質，為開展可可抗寒分子機理研究提供理論基礎、可可抗寒品種培育提供材料來源。

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