姜黃素抑制牙本質膠原降解的初步研究

張 穎 王洪濤 張云燕

廣州市婦女兒童醫療中心口腔科(廣州 510623)

齲病是人類的常見病、多發病。通常當患者因牙齒齲壞造成不適就診時，病損程度多已達牙本質，形成牙本質齲，患者可能會出現牙本質敏感、咬合關系紊亂、牙髓暴露甚至更嚴重的牙齒折斷等，明顯降低患者的生活質量。牙本質是牙齒的主體，主要由有機質和無機質組成。在牙本質的有機成分中，約90%為膠原。牙本質齲的進展主要包括硬組織脫礦和有機質的溶解，有機質的溶解促進牙本質的脫礦。有機質的溶解與牙本質中含有膠原蛋白酶相關。正常牙本質基質中存在潛在形式的前膠原蛋白酶，在齲損牙本質中，細菌及其代謝產物等刺激膠原蛋白酶顯示較高的活性，直接破壞牙本質膠原，并加速牙本質脫礦，進而加快牙本質齲病的進程[1]。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是牙本質有機質中含量最多的膠原蛋白酶之一，是降解牙本質有機質的主要蛋白水解酶。迄今為止在人類機體內發現二十多種，而其中MMP2最早被證明存在于礦化的牙本質中，是牙本質中含量最多的MMPs，其次為MMP9[2]。因此提示降低MMPs活性是抑制牙本質齲進展的方法之一。多項研究顯示姜黃素可以抑制腫瘤組織中MMP2、9的活性[3- 4]，但姜黃素對牙本質中I型膠原的作用尚未見相關研究。本課題初步探討姜黃素對牙本質齲進展過程中膠原降解程度的影響，為阻止牙本質進一步齲壞提供新的思路和理論依據。

1 資料與方法

1.1 牙本質齲模型的建立

1.2 標本的處理

取出脫礦的牙本質塊，4℃下去離子水攪拌沖洗72 h，徹底去除牙塊表面的脫礦液。然后將樣本隨機為五組：① 10 mmol/LDMSO組；② 2 mmol/L APMA(MPPs激活劑，膠原酶潛酶活化劑)組；③ 2 mmol/L EDTA(MPPs抑制劑)組；④ 姜黃素溶液(姜黃素取3 μmol/L、9 μmol/L、12 μmol/L三種濃度)組。將牙本質齲標本置于上述各組溶液中24 h，3 d，7 d，14 d，離心后吸取 100 μL的上清液使用Ⅰ型膠原吡啶交聯終肽(Cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP)ELISA試劑盒(武漢純度生物, 中國)檢測ICPT的表達水平。

1.3 統計學處理

將不同組間ICPT的濃度使用SPSS 13．0軟件進行方差分析，組間比較用q檢驗，顯著性標準α=0.05。

2 結 果

2.1 成功構建牙本質模型

經過脫礦液處理后牙本質呈瓷白色，表面粗糙，電鏡下見牙本質小口完全開放，牙本質小管口完全暴露，管口直徑約3 μm，牙本質小管排列整齊；未經脫礦液處理的牙本質呈淡黃色，表面光滑，電鏡下觀察，見牙本質小管內大量的組織殘渣，甚至堵塞牙本質小管，見圖1。

A.經脫礦液處理后牙本質表面形態B.未經脫礦液處理的牙本質表面形態圖1 牙本質經脫礦后表面形態(×2000)A.經脫礦液處理后見牙本質小管排列整齊,管內清潔,無殘渣; B.未經脫礦液處理的牙本質小管內大量的組織殘渣,甚至堵塞牙本質小管

2.2 ICPT的檢測結果

浸泡溶液的成分和浸泡時間對ICTP的含量均有影響，見圖2。與APMA相比，牙本質齲模型經12 μmol/L的姜黃素處理24 h后，ICTP的濃度降至(0.49±0.04)ng/mL，(F=8.459，P<0.05)，而且隨著處理時間的延長，ICTP的濃度未見明顯升高。牙本質齲模型經APMA處理后ICTP濃度升高，且隨著浸泡時間的延長，ICTP濃度逐漸增加。與APMA相比，EDTA組ICTP的濃度在24 h后降低，仍高于姜黃素組(F=157.151，P<0.05)。說明姜黃素組能快速、有效地降低ICTP的表達水平。

圖2 ICPT的檢測結果

3 討 論

牙本質是牙齒的主體，其化學組成主要是礦物質，占其重量的70%，有機物和水占30%。在牙本質有機成分中，約90%為膠原，以I型膠原含量最多，約占80%。

I型膠原聚集形成直徑約70～90 nm的主纖維，并與直徑約20～40 nm的非膠原蛋白組成的次級分支纖維相連接，構成膠原纖維網，其結構的完整性表現為結構中存在典型67 nm條帶[5]。

正常牙本質基質中存在潛在形式的前膠原酶，MMPs是牙本質有機質中含量最多的膠原蛋白酶之一。MMPs為內肽酶，均以潛酶形式分泌，激活后能從肽鏈中間裂解底物，MMPs活性能為相應的特異性抑制因子所抑制。MMPs是一組鋅依賴性蛋白酶，在中性條件下可以發揮降解細胞外基質的作用，有鈣參與時活性最大，MMPs以無活性的前提形式存在，只用在活化后才能降解細胞外基質[6]。

在齲損牙本質中，MMPs顯示較高的活性，可破壞牙本質膠原，并加速牙本質脫礦[7]。研究顯示牙本質中的MMPS以MMP2、MMP9為主，在牙冠部及根部均有分布。在齲壞牙本質中MMP2，MMP9的活性增加。此外，牙本質細胞分泌的MMP2，MMP9明顯增加，加速牙本質齲病的進程。在治療齲病過程中，由于高速手機的刺激及口內環境中水、酶等各種因素的影響，暴露的膠原纖維在牙本質內固有的MMPs等的作用下發生降解，使混合層的有機成分損耗，導致粘結破壞[8]；牙本質中樹脂粘結單體擴散梯度降低，出現了沿著混合層底部的不完全滲透區域，部分膠原纖維暴露，MMPs被激活，而未被粘結樹脂包裹的膠原纖維會緩慢降解，同樣會影響樹脂粘結界面的退行性變，導致充填物脫落，治療失敗[9]。因此抑制牙本質中MMPs的活性，減少I型膠原的降解是齲病治療的關鍵點之一。

目前臨床上主要有兩類MMPs活性抑制劑，分別為局部用藥和全身用藥。局部用藥將藥物直接涂布于患牙處，局部藥物濃度高，抑制MMPs活性的作用顯著，局部常用的抑制MMPs活性制劑主要有EDTA和0.2%醋酸氯己定等。EDTA盡管具有抑制MMPs活性的作用，但其化學成分促進牙本質脫礦，副作用較大。0.2%醋酸氯己定體外用于抑制牙本質MMPs的濃度大于常用的黏膜消毒濃度(0.05%)，外用刺激性大[10]。常用的全身用藥抑制MMPs活性的藥物如巴馬司他、馬立馬司他、MMI- 270等，常用于腫瘤患者，因毒性大、副作用多、外用性質不穩定、價格較貴等缺點[11]，限制其在牙本質齲中的應用。因此尋找一種安全、經濟、有效的抑制MMPs活性的藥物，對齲病的防治顯得尤為重要。

姜黃素是從亞熱帶地區多年生草本植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，是姜黃中最重要的活性成分，姜黃素的化學結構對稱，含有2個酚羥基、2個甲氧基、2個不飽和羰基和1個活潑的亞甲基，這些基團都是與生物大分子結合的潛在位點。同時，姜黃素毒性低，口服吸收少，生物利用度低，可溶于多種溶劑，在低pH值環境中性質仍然穩定[12]。這提示姜黃素是一種理想的外用劑型。多項研究顯示姜黃素具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等多方面藥理作用[13]。在腫瘤組織中姜黃素具有抑制MMP2、MMP9的活性，從而抑制腫瘤的轉移等多種作用[14]。在牙本質齲中，本實驗證實姜黃素降低I型膠原降解，在預實驗中發現姜黃素的濃度大于12 μmol/L時對細胞具有明顯的毒性。因此本研究中姜黃素的最高濃度選擇 12 μmol/L，當姜黃素的濃度小于12 μmol/L時，隨著姜黃素濃度的增加牙本質膠原降解的量明顯減少。鑒于姜黃素抑制膠原降解，并可以抑制變形鏈球菌生物膜形成的作用[15]，姜黃素具有開發成為阻止牙本質齲進一步進展的天然藥物的潛能。

將來，我們將進一步挖掘姜黃素的藥理作用，開發姜黃素制劑用于治療和預防牙本質齲。同時，進一步研究姜黃素抑制牙本質膠原分解的機制。已有研究表明在不同的腫瘤中姜黃素作用于MMPs的分子機制不同。在口腔鱗狀細胞癌中姜黃素通過p53-E-Cadherin表達，抑制MMP2、MMP9活性，抑制腫瘤細胞轉移[16]。在乳腺癌的模型中，姜黃素通過抑制IκBα激酶活性，抑制IκBα磷酸化和降解，從而通過抑制NF-κB通路，降低MMP2、MMP9的表達和活性[17]。姜黃素加入肝癌細胞培養液中，抑制AKT 和STAT3磷酸化，抑制MMP9活性，從而抑制血管生成[18]。在牙體硬組織中姜黃素作用的具體分子機制不明，我們將進一步深入研究，豐富姜黃素的作用機理。