外源甜菜堿對NaCl 脅迫下紫花苜蓿種子萌發及幼苗抗性的影響

馬婷燕，李彥忠,

（1. 蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010）

有“牧草之王”美稱的紫花苜蓿(Medicago sativa)是推動牧草產業發展過程中的重要牧草[1]。紫花苜蓿屬于中等耐鹽作物[2]，鹽脅迫仍會威脅苜蓿生長造成無法估量的產量損失。鹽堿地土壤是世界上干旱和半干旱地區最普遍的土地資源。截至目前，全世界共有15 億hm2耕地，約7 700 萬hm2(約5%)的可耕地面積均受到不同程度土壤鹽堿化的影響。在中國，鹽化土壤的面積約為3 400 萬hm2，約占總耕地面積的1/3[3]。土壤中適宜含量的鹽分對維持植物正常生理功能方面發揮著重要作用，而過量鹽分導致土壤鹽漬化，使得植物根部吸水困難，植物體內與水分相關的滲透調節受到阻礙，從而導致植株組織結構出現異常，影響生長發育，進而有可能使得栽培地局部小氣候失調，最終影響產量和經濟效益[4]。

甜菜堿(glycine betaine, GB)是一種水溶性生物堿，無毒無害且廣泛存在于動植物中，可以調節細胞滲透壓以維持生物膜及蛋白質結構和功能的完整[5]。當遭受非生物脅迫例如鹽堿、旱澇、高低溫等逆境時，許多植物體內都會積累甜菜堿[6]，但往往因為積累量不夠多而發揮效用微弱。研究發現，添加適量的外源誘導劑如甜菜堿、水楊酸、2,4-表油菜素內酯等可以提高植物的抗逆性，在減少脅迫傷害促生保收方面表現良好[7-9]。幼苗期根試適宜濃度的甜菜堿可以有效緩解鹽脅迫對小麥(Triticum aestivum)幼苗葉片造成的傷害，增加滲透調節物質的含量，并維持相關抗氧化酶活性，提高小麥的抗鹽性[10]。此外，學者們通過施加外源甜菜堿增強棉花(Gossypiumspp.)[11]、玉米(Zea mays)[12]、大麥(Hordeum vulgare)[13]、水稻(Oryza sativa)[14]、番茄(Lycopersicon esculentum)[15]和黑果枸杞(Lyicumruthenicum)[16]等作物的耐性抗性方面取得了一些進展，主要體現在對離子吸收平衡的影響、滲透物質及生物膜透性調節、抗氧化酶活性以及光合功能的改善等。利用外源甜菜堿提高紫花苜蓿耐鹽性研究方面，國內相關報道較少；同時，甜菜堿的合成工藝已非常純熟且具有理化性質穩定，易于被植物吸收的特點[17]。為此，本研究選取在西北干旱、半干旱地區廣泛栽培的‘甘農3 號’紫花苜蓿(Medicago sativa‘Gannong No. 3’)為研究材料，分析兩種施用方式、6 個濃度的甜菜堿對NaCl 脅迫時紫花苜蓿種子萌發及幼苗生長的影響，旨在為利用外源甜菜堿提高紫花苜蓿抗鹽性提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究于2019 年1 月-2 月在蘭州大學草地農業科技學院開展。參試材料為‘甘農3 號’紫花苜蓿由蘭州大學草地農業科技學院提供；外源甜菜堿購自Sigma 公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 處理液配置

150 mmol·L-1NaCl 溶液模擬中度鹽脅迫和外源甜 菜 堿 溶 液0、10、20、30、40、50 mmol·L-1共6 個濃度，對照CK 為蒸餾水替代處理液。

1.2.2 發芽試驗

采用紙上發芽法[18]，在鋪有兩層濾紙的培養皿(直徑90 mm)中同時加入4 mL 處理液[處理液為脅迫液∶緩解液(1∶1)的混合液]，將選取的苜蓿種子室溫下用蒸餾水浸泡40 min，消毒處理經乙醇(75%)浸泡30 s，NaClO(20%)浸泡15 min，滅菌水沖洗5～6 次，最后用濾紙將水吸干，并將種子均勻置于發芽床上，一皿50 粒，共6 個處理，每處理4 次重復，置于恒溫培養箱(溫度25 ℃，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度2 000 lx)，每天采用稱重法加補散失的水分。

1.2.3 盆栽試驗

選擇顆粒飽滿的干凈種子，播入營養土∶蛭石為2∶1 的育苗缽內(直徑為 20 cm, 高度為20 cm)，期間用營養液(改良版Hoagland)和蒸餾水交替澆灌。每缽留長勢一致的幼苗定苗10 株，30 d 后測量株高，采用葉施和根注的方式添加外源甜菜堿，共12 個處理，每處理4 次重復，并設置清水對照CK；葉施時，先用25 mL NaCl 溶液根部灌注，再用25 mL 甜菜堿溶液保證噴施到所有葉片為準；根注時，將NaCl 溶液和甜菜堿溶液各25 mL混合均勻后用注射器注于苜蓿幼苗根部周圍。于試驗處理后的1、3、5 d 時噴施或澆灌相應的處理液，7 d 時采集葉片測定其生理生化指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 發芽指標測定

發芽試驗期間逐日統計發芽數(發芽以胚根突破種皮為準)，14 d 時停止發芽依據以下公式計算發芽相關指標，測胚芽、胚根的長度及組織含水量。發芽勢 = 4 d 發芽種子數/參試種子數 × 100%；發芽率 = 發芽結束時的發芽總數/參試種子數 ×100%；

相對發芽勢 = (處理組發芽勢/對照組發芽勢) ×100%；

相對發芽率 = (處理組發芽率/對照組發芽率) ×100%； ∑

發芽指數 = Gt/Dt；

活力指數 = GI × S；相對發芽指數 = (處理組發芽指數/對照組發芽指數) × 100%；

相對活力指數 = (處理組活力指數/對照組活力指數) × 100%。

式中：Gt為在時間t 日的發芽數，Dt為萌芽日數，GI 為發芽指數, S 為14 d 時的幼苗長度。

1.3.2 盆栽試驗中的株高測定

用直尺測量苜蓿幼苗莖基部到頂葉的距離作為株高，測量時確保頂葉舒展，植株直立。植株增長 = 試驗結束時株高-試驗開始時株高；組織含水量的測定：隨機取10 株處理7 d 后的植株，將根部沖洗干凈，置于濾紙上干燥，用剪刀將根、莖、葉切分，電子天平稱量各組織鮮重(Wf)，放于80 ℃烘箱烘干至恒重，稱量各組織干重(Wd)。組織含水量 = [(Wf-Wd)/Wf] × 100%。

1.3.3 抗逆生理指標測定

采用乙醇提取法測定葉綠素含量[19]，采用蒽酮比色法測定可溶性糖(soluble sugar, SS)含量[19]，采用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸(proline, Pro)含量[19]，采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量[19]。

1.3.4 抗氧化酶活性測定

采用氮藍四唑顯色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)[19]，紫外比色法測定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性[19]，愈創木酚法測定過氧化物酶(peroxidase, POD)活性[19]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010 整理數據并進行圖表繪制；采用SPSS 19.0 進行數據分析。對不同處理的數據選用單因素ANOVA 分析處理，Duncan’s新復極差法進行多重比較(P＜0.05)。以平均值 ±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿種子萌發的影響

2.1.1 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿種子發芽率和發芽勢的影響

NaCl 脅迫下，隨外源甜菜堿濃度的增加，發芽勢和發芽率呈現先升后降的趨勢，其中30 mmol·L-1的甜菜堿處理下發芽勢和發芽率最高，分別為86.50%和96.50%，分別是僅有NaCl 脅迫處理的2.01 倍和1.82 倍(表1)。結果表明，施加適宜濃度的甜菜堿可有效緩解NaCl 對苜蓿種子萌發的抑制作用，低于或高于此濃度，緩解作用都會降低。

2.1.2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿種子發芽指數和活力指數的影響

NaCl 脅迫時，發芽指數和活力指數隨外源甜菜堿濃度的增加呈先升后降的趨勢。當外源甜菜堿在30 mmol·L-1時發芽指數最高，在40 mmol·L-1處理時活力指數最高，分別18.02%和96.26%，是僅有NaCl 脅迫處理的1.73 倍和3.27 倍(表2)。

表 1 NaCl 脅迫下施加外源甜菜堿對苜蓿種子發芽勢和發芽率的影響Table 1 Effects of exogenous glycine betaine on germination potential and germination percentage of alfalfa seeds under NaCl stress

表 2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿種子發芽指數、活力指數的影響Table 2 Effects of exogenous glycine betaine on germination index and vigor index of alfalfa seeds under NaCl stress

2.1.3 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿種子胚根與胚芽生長的影響

在NaCl 脅迫下，當外源甜菜堿施加50 mmol·L-1時苗長最大，施加40 mmol·L-1時根長最大，分別為1.40 和5.51 cm，是僅有NaCl 脅迫處理的1.73 倍和3.04 倍(表3)。

2.2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對盆栽苜蓿幼苗生長的影響

與CK 相比，當NaCl 脅迫時苜蓿幼苗的株高顯著降低，外源甜菜堿在20～40 mmol·L-1范圍內株高明顯增大，當葉面噴施30 mmol·L-1的甜菜堿時株高最大；當根部灌注40 mmol·L-1的甜菜堿時株高最大，二者株高均大于CK (P＜0.05)，且葉施效果要優于根注效果(圖1)。這在一定程度上可以說明，施加外源甜菜堿不僅可以緩解NaCl 的脅迫作用，濃度適宜時還可以促進苜蓿幼苗的生長。

與CK 相比，盆栽苜蓿幼苗經NaCl 脅迫組織含水量顯著下降( P＜0.05)，施加甜菜堿后幼苗含水量開始升高。葉施和根注甜菜堿都在30 mmol·L-1時含水量達最大，但仍小于CK (P＜0.05)。這說明在NaCl 脅迫時，添加甜菜堿可以改善紫花苜蓿幼苗代謝，增強組織儲水能力。

表 3 NaCl 脅迫下施加外源甜菜堿對苜蓿種子胚根與胚芽生長的影響Table 3 Effects of exogenous glycine betaine on the growth of root and germ of alfalfa seeds under NaCl stress

與CK 相比，在NaCl 脅迫下幼苗的葉綠素量開始下降，當施加甜菜堿后葉綠素含量有所回升。當葉施甜菜堿30 mmol·L-1和根注甜菜堿40 mmol·L-1都使葉綠素含量達到最大。這表明，施用一定濃度的甜菜堿能顯著增加葉綠素含量以改善苜蓿幼苗受到NaCl 脅迫時的光合作用條件，提高光合效率，增強植株對高鹽度環境的適應。

圖 1 外源甜菜堿對NaCl 脅迫下苜蓿幼苗株高、組織含水量、葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of exogenous glycine betaine on plant height,tissue water content, and chlorophyll content of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿幼苗滲透調節物質及丙二醛含量的影響

在逆境條件下，可溶性糖(SS)會積累增加來調節細胞的滲透性從而維持植物的生長發育。CK 處理下，SS 含量處于正常水平，而幼苗受到NaCl 脅迫時，SS 含量明顯增加，可降低植物細胞滲透勢，使植株盡可能維持正常的生長代謝水平，平安度過脅迫期。隨著外源甜菜堿濃度的施加，幼苗的SS 含量逐漸上升，當葉施和根注濃度分別在30、40 mmol·L-1時，顯著高于CK (P＜0.05)(圖2)。

游離脯氨酸(Pro)作為一類高效的有機滲透調節物質，在逆境條件下會在植物體內大量累積而維持植物的生長發育水平。與CK 相比，當幼苗受到NaCl 脅迫時Pro 含量開始增大，隨著甜菜堿濃度的增加，Pro 含量也呈增大的趨勢，其中當葉施和 根 施 甜 菜 堿 分 別 在30 和40 mmol·L-1時，Pro 含量最大，且與其他處理差異顯著(P＜0.05) (圖2)。

逆境脅迫條件下膜脂過氧化作用產生對細胞膜有害的MDA，其含量的多少與植物細胞膜受傷害程度正相關。與CK 相比，當植株受到NaCl 脅迫時，MDA 含量大幅度增大，隨著甜菜堿的施用，MDA 含量略有下降，當葉施和根施分別在30 和40 mmol·L-1時，MDA含量下降到最低(圖2)。說明適宜濃度的甜菜堿有效降低苜蓿幼苗細胞膜的受損程度。

2.4 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

與CK 相比，當植株受到NaCl 脅迫時，植物細胞內自由基的平衡遭到破壞，不斷加劇細胞膜的過氧化最終導致植物受到損傷。苜蓿葉片的3 種抗氧化酶的活性都大幅度提升，而兩種方式施加不同濃度的甜菜堿使SOD、POD、CAT 的活性均維持在較高水平，且都隨甜菜堿濃度增加呈現出先上升后下降趨勢，當葉施為30 mmol·L-1時與根注為40 mmol·L-1時，活性均達到最大，與CK 相比差異顯著(P＜0.05) (圖3)。這說明，苜蓿幼苗在受到鹽脅迫時，抗氧化酶系統受到刺激活性增加，而施加適宜濃度的甜菜堿可以維持正常的抗氧化酶活性水平，維持植株的抗逆能力。

圖 2 外源甜菜堿對NaCl 脅迫下苜蓿幼苗SS、Pro 及MDA 含量的影響Figure 2 Effects of exogenous glycine betaine on SS, Pro, and MDA contents of alfalfa seedlings under NaCl stress

圖 3 外源甜菜堿對NaCl 脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of exogenous glycine betaine on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

3 討論與結論

西北地區土壤普遍鹽堿化，而鹽分脅迫主要通過滲透脅迫損害植物細胞膜，造成氧化脅迫以及蛋白質合成受阻等抑制植物的萌發及生長發育。孟繁昊等[20]表明，植物耐鹽性主要依賴于滲透調節保護膜完整性與穩定性、改變光合效率及完成活性氧清除。本研究中，NaCl 脅迫明顯抑制了苜蓿的種子萌發和幼苗生長，相比對照組，鹽脅迫下發芽勢和發芽率、發芽指數和活力指數都顯著下降，幼苗則表現為組織含水量、葉綠素含量、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量均有顯著降低，MDA 急劇升高，SOD、POD 及CAT 的活性明顯增強來響應鹽脅迫環境。

關于對甜菜堿提高植物抵抗環境脅迫的研究已有 許 多[5,7,21-22]。起 初，學 者 們[5,22-23]發 現 植 物 體 內產生的甜菜堿對于調控植物抗鹽抗旱等不良環境方面發揮著關鍵作用。然而在生產實踐中，并非所有種類的植物在受到環境脅迫時都能產生并積累足夠量的甜菜堿[24-26]。后來研究者們針對添加外源甜菜堿和甜菜堿合成基因工程在提高植株抗逆能力方面進行了長期且深入的研究[22,27-28]。一些研究表明[29-32]，鹽、低溫、干旱等非生物脅迫可誘導內源甜菜堿的合成與積累量增加以增強抗逆水平；董文科等[29]研究表明，通過葉施或根施外源甜菜堿也可誘導植物增加內源甜菜堿的合成量，對于植物抵御低溫等非生物脅迫也有幫助。梁超[33]通過轉基因方式將BADH 基因導入小麥(Triticum aestivum)，在小麥中表達而使葉片中甜菜堿過量積累，提高葉片相對含水量，維持葉片的水分狀況，并增加葉綠素含量，光合效率得以提高從而增強了小麥的耐鹽能力。孫文越等[34]研究了外源甜菜堿對干旱脅迫下小麥生理變化影響，發現外源甜菜堿可以使小麥葉片含水量降低，相對電導率增大，MDA 含量上升，游離脯氨酸大量積累，抗氧化酶活性先降后增，得出外施甜菜堿會加深對小麥幼苗受傷害程度的結論。這與許多學者的研究結果相悖，推測可能是因為外源甜菜堿被小麥的吸收太少得出此結果。這些研究可以說明，甜菜堿吸收及積累量的增加有助于增強植物在抵御逆境脅迫的能力，抵御機制同抗逆機理類似中[35]。

植物生長發育的最基礎環節是種子萌發，因此種子的耐鹽能力顯得非常關鍵。本研究中，與對照相比，當外源甜菜堿施加范圍在20～40 mmol·L-1時苜蓿種子在萌發過程中的鹽抑制作用得到不同程度的緩解，并且在30 mmol·L-1外源甜菜堿的水平下，發芽情況達到鹽脅迫下的最好狀態。許高平等[36]研究發現，用甜菜堿浸種能夠顯著提升干旱與鹽脅迫下玉米(Zea mays)種子的發芽勢發芽率。已有很多類似研究表明，在鹽脅迫下添加外源甜菜堿明顯會改善煙草(Nicotiana tabacum)、枸杞(Lycium barbarum)、番茄(Solanum lycopersicum)和白三葉(Trifolium repens)等種子的萌發情況[24,37-39]，與本研究結果一致。葉綠素是植物光合作用中的關鍵部分，其含量的多少在一定程度上可以反映植物的光能吸收、轉化和傳遞能力，其含量與葉片光合速率、外界環境條件等緊密相關，因此葉綠素含量一定程度能表征植物生長狀況[40-41]。本研究中，與對照相比，外源甜菜堿能增加NaCl 脅迫下苜蓿幼苗的株高、組織含水量、葉綠素含量，當葉施30 mmol·L-1和根注40 mmol·L-1的水平時，各指標值顯著大于對照處理，說明適宜濃度的甜菜堿能夠維持葉片的水分狀況，同時增加光合效率，從而抵御鹽脅迫并且促進苜蓿幼苗的生長發育。梁超[33]研究表明，甜菜堿保護逆境條件下葉綠體體積不受鹽脅迫，促進葉綠素合成，改善光合效率以增加生物量積累來增強植株抗鹽性，這與本研究的結果符合。

可溶性糖和游離脯氨酸可通過調節原生質水溶液的滲透壓來保護植物細胞膜[42-44]。本研究表明，幼苗葉片在NaCl 脅迫時，SS 和 Pro 含量提高，降低了鹽脅迫對植物細胞造成的傷害，而外源甜菜堿無論葉施還是根注都可以繼續增加這兩種物質的含量，分別在30 mmol·L-1和40 mmol·L-1達到最大，進一步表明外源甜菜堿可有效提高苜蓿的抗鹽性。孟祥浩[45]在小麥抗鹽試驗中發現，小麥葉片脯氨酸含量隨鹽濃度增大及脅迫時間延長而有不同程度的增加，耐鹽品種的脯氨酸含量積累明顯較多，說明游離脯氨酸含量的積累增多可有效提高小麥的耐鹽性。丙二醛能與膜結構上的蛋白質或酶結合、交聯而使其失去活性，膜結構被破壞，因此MDA 含量可以有效反映生物膜系統受損程度和膜脂過氧化程度[46-48]。本研究中，NaCl對幼苗造成脅迫時，MDA 含量較CK 處理急劇增加，說明鹽逆境加劇了膜脂過氧化程度，生物膜系統受損。隨著甜菜堿溶液濃度的增加，幼苗葉片中的MDA 含量相應有所降低，葉施和根注外源甜 菜 堿 分 別 在30、40 mmol·L-1時 葉 片MDA 含 量降到鹽脅迫下最低水平。原因可能是甜菜堿可以保護酶蛋白結構和功能的完整性，阻礙了MDA 對膜的損傷，維持植物細胞的正常工作，從而提高了苜蓿抗鹽性。李蕓瑛等[30]利用外源甜菜堿處理黃瓜(Cucumis sativas)幼苗，結果也表明外源甜菜堿可以有效保護低溫脅迫對幼苗的傷害而抑制MDA合成，以防止膜脂過氧化加劇，維持了生物膜系統的平衡。

鹽脅迫會使植物產生大量活性氧自由基，造成植物細胞膜損傷。因此，提高抗氧化酶活性來清除活性氧自由基對植物在鹽逆境下的存活至關重要。SOD、POD 和CAT 是3 類與植物抗逆機制相關的抗氧化關鍵酶，抗氧化關鍵酶活性的提高能一定程度上減緩植物細胞受到的氧化損傷[49-52]。本研究中，鹽脅迫時幼苗葉片的這3 種酶活性較CK 相 比 略 有 提 高，而 葉 施30 mmol·L-1和 根 注40 mmol·L-1外 源 甜 菜 堿 時 這3 種 酶 活 性 顯 著 提高，說明外源甜菜堿可以激發抗氧化酶活性，以清除過多活性氧自由基。研究發現，甜菜堿可以與酶蛋白結合，維持酶蛋白構象的穩定性，使酶蛋白處于激活狀態，同時維護呼吸酶及能量的代謝過程，增加保護酶活性以清除體內的活性氧自由基，保護細胞、蛋白質和酶不受來自不良土壤環境與極端天氣等外界因素的影響，最終提高了植物抵御逆境脅迫的能力[17,53-54]。梁超[33]通過基因工程證明，過量積累甜菜堿可以保護植株在鹽脅迫下各種抗氧化酶活性，減少活性氧的積累，降低MDA 水平，維持生物膜的有序性。這與本研究結果一致。

本研究中，葉片噴灑在30 mmol·L-1時，根部灌注在40 mmol·L-1時，各項生理指標顯示苜蓿幼苗的生長狀態與抗逆狀態達最佳效果。這可能是因為用于培育幼苗的土壤介質中本身存在一類化合物(醛類和有機酸等)[55]，能夠和甜菜堿中的元素或衍生物產生特異性反應結合，降低甜菜堿的濃度和吸收量，也可能因為外源甜菜堿從根部向葉片吸收運輸的過程中有損耗，使得植株葉片得以積累利用的甜菜堿量較少，從而降低了抗鹽效果，因此根注所需甜菜堿濃度要大于葉施所需濃度。這說明外源甜菜堿對植物抗逆性的影響與其施加方式和濃度有一定的關系。

綜上可以得知外源甜菜堿一定程度下有助于增強紫花苜蓿萌發生長發育在鹽逆境下的抗逆能力。在NaCl 脅迫時，0～50 mmol·L-1的外源甜菜堿處理提高了紫花苜蓿種子萌發指標，增加了幼苗的葉綠素、可溶性糖和游離脯氨酸的含量，降低了丙二醛的積累，顯著提高抗氧化酶的活性，使苜蓿種子萌發期與幼苗期的抗鹽能力得到不同程度的提升。在葉面噴施濃度為30 mmol·L-1外源甜菜堿，根部灌注濃度為 40 mmol·L-1的處理下效果最佳。