復配防腐劑抑制雞蛋干腐敗菌效果研究

賀 燕 譚純良 - 李 娜 周紅麗 - 王曉慶 -

(1. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；2. 湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128)

雞蛋干是中國市面上常見的佐餐食品，因其風味獨特而深受消費者喜愛。由于生產原料以全蛋液為主，操作不當容易使雞蛋干受微生物污染而變質[1]。筆者在調查中發現預包裝雞蛋干即便經過高壓蒸汽滅菌后還會出現脹包、湯汁渾濁、有異味的變質現象，尤其是夏秋高溫季節雞蛋干發生腐敗變質現象機率更高。課題前期研究發現，經高溫殺菌以后出現腐敗變質的雞蛋干的主要腐敗細菌為地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002兩種，但目前未見對雞蛋干中這兩種腐敗菌的抑制或殺滅技術的研究報道。

雞蛋干屬于熱凝固蛋制品。根據GB 2760—2014對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、山梨酸4種防腐劑可添加至雞蛋干中，但單獨加入這4種防腐劑難以取得較好的防腐效果。ε-聚賴氨酸、納他霉素、溶菌酶3種生物防腐劑具有安全性高、抑菌效果好、抑菌譜廣的特點，且在蛋卷、中西式糕、蛋黃醬、沙拉醬等產品中的防腐應用效果佳[2]。因此，試驗擬以地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002為抑制對象，通過抑菌試驗從上述7種防腐劑中篩選高效防腐劑并優化復配防腐劑配比，以期獲得一種高效的雞蛋干防腐劑，為延長雞蛋干的貨架期和保障食用安全性提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、芽孢桿菌LAMI 002(Bacillussp. LAMI 002)，從腐敗雞蛋干中分離純化得到；

山梨酸鉀、對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽、納他霉素、乳酸鏈球菌、ε-聚賴氨酸、溶菌酶：食品級,純度99.0%，浙江一諾生物科技有限公司；

無水乙醇、NaCl：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；

結晶紫：AR級，北京索萊寶科技有限公司；

濾膜：0.22 μm，德國Membrana公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外光柵分光光度計：752型，上海精密科學儀器有限公司；

光電分析天平：FA2004型，上海精科實業有限公司；

電熱鼓風干燥箱：DGG型，天津天宇機電有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YXQG01型，山東新華醫療器械廠；

全波長酶標儀：Multiskan FC型，美國Thermo Labsystem公司。

1.1.3 培養基

雞蛋干培養基：稱取正常雞蛋干約30.0 g，切成1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm片狀，放置于培養皿中，于121 ℃，15 min滅菌后備用，24 h內使用；

平板計數瓊脂培養基、LB培養基、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.4 相關溶液

1 mol/L HCl溶液：量取83.3 mL濃HCl，用蒸餾水定容至1 L；

3.0 g/kg納他霉素備用液：準確稱取0.30 g納他霉素，用0.02 mol/L HCl溶解并定容至100 mL，24 h內使用；

1.5 g/kg山梨酸鉀備用液：準確稱取0.15 g山梨酸鉀，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無菌條件下過濾，24 h內使用；

2.0 g/kg乳酸鏈球菌素備用液：準確稱取0.20 g乳酸鏈球菌素，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，使用前搖勻并于24 h內使用；

2.0 g/kgε-聚賴氨酸備用液：準確稱取0.20 gε-聚賴氨酸，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無菌條件下過濾，24 h內使用；

2.0 g/kg溶菌酶備用液：準確稱取0.20 g溶菌酶，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無菌條件下過濾，24 h內使用；

2.0 g/kg對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽備用液：準確稱取0.2 g對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無菌條件下過濾，24 h內使用。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

(1) 單一菌菌懸液的制備：參考Veronica等[3-6]的方法，分別將地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002接種到5 mL LB培養基中，37 ℃培養24 h后，取1 mL菌懸液以10 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水洗絳沉淀，然后將沉淀重懸于0.5 mL無菌生理鹽水中，得到107CFU/mL 的菌懸液，備用。

(2) 混合菌菌懸液的制備：前期研究中從腐敗雞蛋干中分離、培養得到的地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002的菌落數比例約為1∶1，因此將上述制備的兩種單一菌的菌懸液按體積比1∶1進行混合，獲得混合菌懸液，備用。

1.2.2 不同防腐劑對混合腐敗細菌的抑菌效果 根據GB 2760—2014對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、山梨酸在雞蛋干制品中的最大添加量分別為0.20，0.25，1.50，1.50 g/kg。依據文獻資料[7-9]試驗設置ε-聚賴氨酸、納他霉素、溶菌酶最大添加量分別為0.15，0.03，0.50 g/kg。試驗中每種防腐劑的濃度設置成3個梯度，分別為上述最大允許添加量、1/2最大添加量、1/4最大添加量。

對以上7種防腐劑進行牛津杯抑菌試驗：將已滅菌的平板計數培養基加熱到完全融化，倒在培養皿內，每皿15～20 mL，待培養基凝固后使用移液器吸取1.2.1中混合菌菌懸液100 μL置于培養皿表面，使用涂布法將菌液涂布均勻。將牛津杯垂直放置在培養基表面并輕輕加壓以接觸介質而沒有空隙。分別在杯中加入不同種類不同濃度的防腐劑溶液150 μL。標記牛津杯擺放位置、防腐劑類型及其濃度，并將平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h。以未添加防腐劑的為空白對照組，用游標卡尺對結果進行記錄。

1.2.3 單一優選防腐劑最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 將一定量的防腐劑加入LB液體培養基中以制備含有不同濃度防腐劑的LB培養基，然后進行2倍梯度稀釋，并按濃度的降序依次加入到8×12型無菌96孔板中，每孔添加200 μL，再向每孔中加入細菌菌懸液5 μL。添加后，用酶標儀測定吸光值OD600 nm，然后將含有細菌的96孔板置于37 ℃培養箱中靜置培養12 h。每隔2 h使用酶標儀測每孔OD600 nm一次，兩個相鄰濃度在培養12 h后△OD600 nm≤20%則兩者濃度大的為該防腐劑的最小抑菌濃度。第11孔不加防腐劑作為生長對照，第12孔不加菌液作為空白對照，若空白對照污染，則試驗失敗，每組試驗4次平行[10]。

在無菌條件下，從MIC和大于MIC濃度的孔中取出100 μL培養液，然后涂布到LB平板上，將細菌置于37 ℃培養箱中12 h。培養結束后，觀察菌落總數并計數，MBC為無菌落生長的最低防腐劑培養濃度。

1.2.4 單一優選防腐劑對地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002混合菌的抑制效果 以腐敗雞蛋干中的腐敗細菌地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌 LAMI 002的混合菌懸液作為供試樣品，檢驗單一防腐劑溶菌酶、ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素的抑菌效果。參照GB 2760—2014及相關文獻[11-12]食品添加劑最大允許添加量，分別制備含不同濃度的防腐劑(各防腐劑最大允許添加量的100%，85%，70%，55%，40%，25%，10%，0%)的LB培養基，根據1.2.3 方法進行操作后于37 ℃培養箱中靜置培養12 h后使用酶標儀測定OD600 nm。每組試驗4次平行，以OD值較小且防腐劑濃度添加量低的相鄰兩防腐劑添加濃度作為優化添加濃度范圍。

1.2.5 響應面法優化復配防腐劑配比 根據單一防腐劑的抑菌效果試驗結果，以OD600 nm為響應值(R)，設計三因素三水平Box-Behnken試驗優化復配防腐劑配比，每組試驗設3組平行。

1.2.6 復配防腐劑抑菌效果驗證 在雞蛋干培養基(1.1.3)中添加相應劑量復配防腐劑，同時以添加相應劑量無菌超純水的空白作為對照，然后分別接種100 μL混合腐敗菌菌懸液。密封真空包裝后，置于37 ℃恒溫培養48 h，按GB 4789.2—2016測定樣品中的菌落總數進行驗證。

2 結果與分析

2.1 不同防腐劑對混合腐敗細菌抑菌效果

從圖1可以看出，最大添加量時，乳酸鏈球菌素對混合菌的抑制圈直徑最大，其次是ε-聚賴氨酸和溶菌酶。乳酸鏈球菌素與溶菌酶的抑菌圈直徑隨著防腐劑濃度的降低明顯減小。當乳酸鏈球菌素濃度為0.25 g/kg時抑菌圈直徑為26.91 mm，相比山梨酸鉀、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽優勢明顯。ε-聚賴氨酸、溶菌酶兩種抗菌劑的抑菌圈直徑會隨著添加量的增加而增大，抑菌效果明顯。結果表明，單一生物防腐劑對混合菌種的抑制效果優于單一化學防腐劑，可能是腐敗菌種均為芽孢桿菌，對環境耐受性較強，而生物防腐劑例如溶菌酶能直接破壞細菌的細胞壁，使其失活。因此選擇ε-聚賴氨酸、酸溶菌酶和乳酸鏈球菌素作為優選防腐劑。

2.2 單一優選防腐劑對腐敗菌株的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

圖2、3分別為單一優選防腐劑(乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸和溶菌酶)對地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002的劑量反應曲線。

圖1 不同防腐劑對混合腐敗細菌抑菌圈大小

圖2 不同防腐劑對地衣芽孢桿菌的劑量反應曲線

圖2(a)中，當乳酸鏈球菌濃度為0.250 0 g/kg時，地衣芽孢桿菌的生長和代謝被抑制，但菌體細胞沒有完全被殺死；提高劑量至2.000 0 g/kg時，能完全抑制該菌生長，破壞菌體，使其進入衰亡期。圖2(b)中ε-聚賴氨酸效果在0.125 0 g/kg的條件下，可以完全抑制地衣芽孢桿菌的生長，增加劑量后效果更好。圖2(c)中溶菌酶的用量需要達到0.500 0 g/kg才能完全抑制地衣芽孢桿菌的生長。圖3(a)中乳酸鏈球菌素在0.125 0 g/kg的條件下，可以完全抑制芽孢桿菌的生長。圖3(b)中單獨添加ε-聚賴氨酸時，需要達到0.250 0 g/kg的劑量才能對芽孢桿菌有明顯的抑制效果。圖3(c)中溶菌酶在0.125 0 g/kg時可以抑制芽孢桿菌的生長。由圖2、3可知，3種防腐劑的添加量達到某一濃度時均能完全抑制地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002，但是單一防腐劑不能在允許添加濃度范圍內同時抑制兩種菌的生長。不同防腐劑的MIC和MBC值如表1所示。

圖3 不同防腐劑對芽孢桿菌LAMI 002的劑量反應曲線

綜上所述，兩種菌對不同防腐劑的敏感程度不一樣，地衣芽孢桿菌對ε-聚賴氨酸最為敏感，對溶菌酶有較強的耐受作用；芽孢桿菌LAMI 002對于3種生物防腐劑都比較敏感，只需使用少量防腐劑即可抑制其生長，但對ε-聚賴氨酸的耐受性較強。單一防腐劑在允許添加范圍內不能同時抑制兩種菌的生長，因而須考慮多種防腐劑的復配。

2.3 單一優選防腐劑對地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌 LAMI 002混合菌的抑制效果

由圖4可以看出，溶菌酶在添加量為40%時吸光度值出現最小值，因此選擇25%～55%的添加濃度作為優化濃度范圍；ε-聚賴氨酸在添加量為100%時吸光值出現最小值，在該濃度下腐敗混合菌依舊能生長，而在添加量為40%時吸光值出現了次小值且與最大添加濃度的吸光值差值約為0.039，故選擇25%～55%的添加濃度作為優

圖4 不同濃度單一防腐劑對混合菌株吸光值的影響

Figure 4 Effect of single preservative at different concentrations on absorbance

表1 不同防腐劑的MIC和MBC

化濃度范圍；乳酸鏈球菌素在整個允許添加范圍內變化較小，在25%的添加濃度時吸光值出現最小值，所以選擇10%～40%作為優化濃度范圍。

2.4 復配防腐劑配化的優化

2.4.1 試驗因素及水平 根據2.2的防腐劑抑菌效果設置因素水平見表2。

2.4.2 響應面設計及試驗結果分析 各因素水平、編碼設計及試驗數據結果如表3所示。

根據Design Expert 10軟件對所得數據進行回歸分析，得回歸方程模型：

表2響應面分析法的因素與水平表

Table 2 Codes and levels of factors for response surface for methodology experiment g/kg

R=0.204+9.188×10-3A+0.016B-3.375×10-3C+0.012AB-8.500×10-3AC+0.032BC+0.013A2+0.031B2+0.051C2。

(1)

對試驗驗結果進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析與回歸方程系數估計值，如表4所示。

表3 Box-Behnken設計與試驗結果

由圖5可知，隨著溶菌酶與聚賴氨酸使用量增多OD600 nm值升高，越不能抑制微生物生長，可能是ε-聚賴氨酸和溶菌酶在該濃度下可以抑制混合菌種的某一種菌的生長，但是不能抑制另一種菌的生長。由圖6可知，溶菌酶與乳酸鏈球菌素的相互作用中，溶菌酶對于微生物的抑制效果較為穩定，使用量的變化對抑菌效果影響不大，乳酸鏈球菌素在使用0.062 5 g/kg左右時出現極小值，由圖7可知，ε-聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素對于抑制腐敗菌的生長有一定的交互作用，根據等高線呈橢圓狀可知其交互作用顯著。

2.4.3 復配防腐劑配比的確定 根據Box-Behnken設計試驗所得的結果與回歸方程，利用Design Expert 10軟件分析可得：復配防腐劑中各組分配比為溶菌酶0.185 2 g/kg，ε-聚賴氨酸0.054 1 g/kg，乳酸鏈球菌素0.066 3 g/kg，OD600 nm達到理論最小值0.201。按該組合進行驗證實驗(平行3次)，實測OD600 nm為0.212，與理論值接近。說明試驗值與模型預測值吻合良好。

2.5 復配防腐劑抑菌效果驗證

從表5可以看出，復配防腐劑組的樣品外表仍然光滑且富有韌性，雞蛋干表面析出的水較少且透明，有雞蛋干固有的微黃色，沒有腐敗臭味，菌落總數得到了明顯控制；對照組樣品表面粗糙，使用玻璃棒輕戳即碎成顆粒狀，表面析出的水呈渾濁狀，顏色和工廠生產的腐敗雞蛋干一致，嚴重褪色，有濃烈的腐敗味道。目前雞蛋干暫無國家衛生標準規定，企業標準通常規定菌落總數不得超過105CFU/g，試驗發現對照組于37 ℃恒溫培養48 h時已超出該范圍，但復配防腐劑的僅為2.7×103CFU/g。

表4 回歸方程的方差分析?

? *表示P<0.05水平為顯著，**表示P<0.01水平為極顯著。

圖5 溶菌酶與ε-聚賴氨酸的交互作用

圖6 溶菌酶與乳酸鏈球菌素的交互作用

圖7 ε-聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素的交互作用

表5 雞蛋干質量評價

說明復配防腐劑能對雞蛋干中的腐敗細菌進行有效抑制，防止了產品變質。

3 結論

通過抑菌試驗從7種防腐劑中篩選出ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素和溶菌酶3種高效防腐劑，其中ε-聚賴氨酸對地衣芽孢桿菌的抑制效果較好，乳酸鏈球菌素和溶菌酶對芽孢桿菌LAMI 002的抑制效果較好。通過響應面法優化試驗確定最佳復配防腐劑配方為溶菌酶0.185 2 g/kg，ε-聚賴氨酸0.054 1 g/kg，乳酸鏈球菌素0.066 3 g/kg。驗證實驗中混合腐敗菌得到了有效控制，菌落總數減少了99.07%。但此研究目前還僅在實驗室里進行小試，未進行中試和實際生產應用，實際生產中可能存在的問題和缺陷還有待于發現和解決。