液相色譜—串聯質譜法測定番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量

陳景春 -

(上海必諾檢測技術服務有限公司，上海 201114)

敵菌靈化工產品學名2,4-二氯-6-(鄰氯代胺基)均三氮苯，由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得到的一種殺菌劑，外觀為白色至黃色結晶，熔點159～160 ℃，能溶于鏈烴類和其他多數有機試劑，如甲苯、二甲苯、丙酮等(在堿性介質中30 ℃以下即可分解)[1-2]。敵菌靈具有低毒、內吸性和殺菌譜較廣等特點[3]，主要用于防治瓜類中常見的黑星病、炭疽病、霜霉病，水稻中的稻瘟病、胡麻葉斑病、煙草赤星病，番茄斑枯病以及各種農作物中常見的灰霉病等。

農藥在農業生產過程中無可避免地被使用，對環境和生物鏈均有極大的破壞性，而水果、蔬菜上的農藥殘留問題也是由來已久的，已經對人體健康和生命安全造成了嚴重的威脅[4]。隨著人類對農藥殘留問題的日益重視，日本、美國及歐盟國家都制定了相關標準，規定了在水果、蔬菜和糧食中的最大殘留限量值，并對其殘留量進行監測。日本農藥注冊保留標準規定果品(草莓除外)、蔬菜、甜菜等敵菌靈最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg、草莓為20 mg/kg，中國在GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定了敵菌靈在黃瓜和番茄中的最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg。

農藥殘留分析的樣品種類繁多，化學組成復雜，要使分析儀器能檢測到痕量的殘留農藥，需對樣品進行必要的提取、濃縮和凈化處理[5-6]。固相萃取是近年發展起來的一種樣品預處理技術，由液固萃取和液相色譜柱技術相結合發展而來，能有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力，現已廣泛應用于農藥殘留的分析中[7]。目前，測定蔬菜、水果中敵菌靈農藥殘留量的檢測文獻和標準方法主要集中在高效液相色譜法[8-10]和氣質聯用法[11-12]等，但液相色譜及氣質聯用法在實際使用中，存在靈敏度較低，選擇性較差、分子離子峰難以識別、不能準確區分干擾物及目標物等缺點，文獻[12]使用液相色譜—質譜聯用法檢測敵菌靈但并未對樣品進行凈化及濃縮。

試驗擬通過固相萃取進行凈化，結合高效液相色譜—串聯質譜高選擇性、高靈敏性的優勢，對組分復雜的樣品進行實時分析，以期能夠提供精準的目標物結構信息、相對分子質量等信息，為判定目標物提供依據。

1 試驗部分

1.1 試驗設備

電子分析天平：BP211D型，德國Sartorius公司；

高效液相色譜—質譜聯用儀：Agilent 1290+6470型，美國安捷倫公司；

高速冷凍離心機：Sovall ST16R型，美國賽默飛世爾公司；

漩渦振蕩器：Basic Vortex Mixer型，美國Talboys公司；

氮吹儀：DC-24型，上海安譜實驗室科技股份有限公司。

1.2 材料與試劑

番茄、黃瓜：購自上海大潤發超市；

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮、甲酸：色譜純，美國Sigma公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

敵菌靈標準物質：(99.0±1.0)%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美國Waters公司。

1.3 樣品提取及凈化

準確稱取粉碎均勻的樣品10 g(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中，準確加入20 mL乙腈溶液，用高速勻漿機均質1 min，加入3～5 g氯化鈉于離心管中，蓋上瓶蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振蕩5 min。在4 ℃條件下，以8 000 r/min 離心10 min，移取乙腈層至圓底燒瓶中，殘渣用20 mL乙腈反復提取1次，合并乙腈層，于40 ℃旋轉蒸發至近干，加入3.0 mL正己烷振蕩溶解，待凈化。

依次使用3 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)和正己烷分別預淋洗弗羅里硅土固相萃取柱，待正己烷接近流盡時，加入待凈化液， 用50 mL梨形瓶接收洗脫液，用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)分3次沖洗圓底燒瓶后過弗羅里硅土固相萃取柱，收集洗脫液，在40 ℃條件下旋轉蒸發至近干。用1 mL甲醇溶液溶解，經0.22 μm有機相濾膜過濾，待上質譜分析。

1.4 液相及質譜分析條件

1.4.1 液相部分 色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm ×100 mm)；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液(流動相梯度洗脫條件具體見表1)；流動相流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；色譜柱溫：40 ℃。

1.4.2 質譜部分 離子源類型：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：1.2 kV；毛細管電壓：3 500 V；

表1 流動相梯度洗脫條件

掃描方式及監測方式分別為正離子掃描及多反應監測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：11 L/min；去溶劑氣流量：11 L/min；去溶劑氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：172 kPa；在正離子掃描模式下，直接進樣敵菌靈標準溶液并進行母離子全掃描，確定以分子離子m/z275為母離子，然后對其進行子離子掃描，得到2個監測離子分別為153和214，并且通過調節毛細管電壓，錐孔電壓及碰撞能量等，優化質譜參數，并得到最終結果。具體數值見表2。

表2 敵菌靈的多反應監測質譜參數

1.5 標準貯備液及標準工作曲線繪制

準確稱取敵菌靈農藥標準品，用甲醇定容，得到濃度為1 mg/mL標準貯備液，并置于4 ℃冰箱保存。分別吸取適量敵菌靈農藥標準貯備液，用甲醇稀釋成標準工作液，在空白基質中分別添加0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg的敵菌靈標準溶液，按樣品同樣處理后上機測定，得到敵菌靈的標準工作曲線。敵菌靈標準品圖譜見圖1。

圖1 敵菌靈標準品圖譜

1.6 樣品提取溶劑的選擇

根據化學性質，敵菌靈易溶于甲醇、乙腈、丙酮等多數有機試劑，在水中幾乎不溶解[1-2]。試驗選取了3種在農藥殘留檢測中常用且極性各不相同的提取試劑：乙酸乙酯、丙酮和乙腈。通過在空白基質中添加敵菌靈標準品，并使用這3種試劑進行提取，測定其樣品回收率。

1.7 凈化固相萃取柱的選擇

凈化是樣品前處理部分的關鍵環節，選取合適的固相萃取柱能夠有效地去除基質中的雜質，縮短凈化時間，有效富集被測物，大大提高檢測的靈敏度。方法選擇GCB固相萃取柱及Florisil柱進行比對，通過添加敵菌靈標準溶液，經過固相萃取柱凈化后，測定其回收率，對其進行比較。

1.8 凈化固相萃取柱的選擇

于15 mL試管中加入適量的敵菌靈標準工作液，氮吹至近干后，加入3 mL正己烷溶解，渦旋混和均勻，通過預淋洗完的Florisil柱，分別用5，10，15，20 mL 4種不同用量的正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進行洗脫，同時收集洗脫液，40 ℃條件下氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，經0.22 μm有機相濾膜過濾，上機分析。

1.9 基質效應的評價

吸取適量敵菌靈農藥標準貯備液，分別使用甲醇及空白樣品處理液進行定容，得到相同濃度的工作液后上機測定。

2 結果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

提取結果顯示，乙酸乙酯、丙酮和乙腈3種試劑均能有效提取敵菌靈，回收率分別為95%，92%，97%(均大于80%)，能達到農藥殘留分析的要求[13]。其中使用乙腈提取時，在提取液加入氯化鈉并振蕩離心后能夠與水相有效分離，而丙酮卻難以與基質中的水分離，為下一步的凈化工作帶來困難。與此同時，乙腈相較于乙酸乙酯，在樣品中提取出的色素、脂肪、蛋白等雜質少，有利于下一步的凈化。綜合考慮，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化固相萃取柱的選擇

通過試驗發現，GCB柱具有優異的色素、雜質吸附性能，但對被測物有較強的吸附，且難以洗脫，造成試驗整體回收率偏低，其回收率在70%左右，而相對Florisil柱的回收率達到95%。故方法選擇色素吸附性能稍弱，但利于被測物洗脫，能夠滿足試驗回收率要求的Florisil固相萃取柱作為凈化用固相萃取柱。

過GCB、Florisil固相萃取柱標準品圖譜見圖2、3。對比圖2～3可知，GCB固相萃取柱和Florisil固相萃取柱都能基本去除基質中的干擾雜質，但使用GCB柱凈化相對回收率較低，綜合被測物回收率及凈化效果，最終選擇Florisil固相萃取柱為凈化用固相萃取柱。

圖2 過GCB固相萃取柱標準品圖譜

Figure 2 MRM chromatogram of anilazine through GCB solid phase extraction column

圖3 過Florisil固相萃取柱標準品圖譜

Figure 3 MRM chromatogram of anilazine through florisil solid phase extraction column

2.3 固相萃取柱洗脫液的選擇

淋洗液與回收率圖譜見圖4。由圖4可知，洗脫液使用量為5 mL時，敵菌靈的回收率僅達到25%左右，并不能滿足農殘分析要求；當洗脫液用量提高到15 mL時，幾乎能完全將敵菌靈洗脫，回收率達到95%；增加使用量至20 mL時，未能顯著提高回收利率，故在綜合成本及效率因素考慮后，方法選擇使用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進行洗脫。

圖4 淋洗液與回收率圖譜

2.4 基質效應的評價

經過上機測定后發現，在番茄及黃瓜基質中敵菌靈的離子化效率較甲醇溶液中低，基質效應在80%左右，結果見表3。故在樣品分析時采用相同基質內添加標準物質進行標準曲線校正以消除基質效應的影響。

2.5 線性關系與檢出限

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制敵菌靈標準工作曲線如圖3所示，在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內呈線性關系，線性方程為Y=172.63X-335.62 (R2=0.999 8)。

同時以3倍信噪比，測得敵菌靈方法檢出限為0.01 mg/kg；以10倍信噪比，測得敵菌靈方法定量限為0.03 mg/kg。

圖5 敵菌靈的標準工作曲線

2.6 準確度及精密度試驗

采用標準物質添加法，選取番茄及黃瓜陰性樣品，分別添加0.03，0.10，0.50 mg/kg進行回收率試驗，每個添加水平重復測定6次，測定后得到敵菌靈在番茄及黃瓜基質中的回收率及相對標準偏差(RSD)見表4。

3 結論

試驗采用固相萃取前處理，建立了高效液相色譜—串聯質譜法測定番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的方法，并優化了試驗條件，在保證分離度的前提下，采用固相萃取小柱凈化，以C18色譜柱為分離柱，以甲酸水—乙腈為流動相進行梯度洗脫，經LC-MS/MS檢測，以多反應監測模式監測目標化合物的特征離子進行定性定量分析。該方法添加回收率在88.3%～95.2%，變異系數在4.5%～8.8%。試驗證明高效液相色譜—串聯質譜法前處理方法簡單、分離被測物能力強，能準確定量、定性；能夠節省分析時間，提高檢測效率。使用試驗方法完全可以滿足番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的日常檢測需求。但由于研究過程中，采用基質種類與數量有限，在葉菜類等類似基質樣品中的利用有待進一步的探索和研究。

表4 敵菌靈回收率及相對標準偏差測定結果