UPLC-PDA法同時測定連翹中4種成分的含量

劉 芳，魏 娟,，張曉燕,，熊先明，祝 宇,，余世榮*

（1.十堰市人民醫院（湖北醫藥學院附屬人民醫院）藥學部，湖北 十堰 442000；2.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000；3.兵兵宏康中藥飲片（十堰）有限公司；湖北 十堰 442510）

連翹是木犀科植物連翹Forsythia suspense(Thunb.) Vahl的干燥果實，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效，按采收期的不同分為分青翹和老翹[1]。主要含苯乙醇苷類、黃酮類、木脂素類、萜類、揮發油類等化合物[2-5]。《中國藥典》2015年版中規定以代表性的苯乙醇苷（連翹酯苷A）和木脂素類化合物（連翹苷）為連翹藥材的質量評價指標。然而根據中藥具有多成分、多靶點的特點，單一的成分很難全面反映連翹藥材質量，采用多個指標性成分進行質量評價更具有科學性和全面性。

現代藥理研究表明，槲皮素具有抗心肌缺血再灌注損傷、抗炎、抗腫瘤、抗高尿酸、抗高血糖等作用[6-10]。連翹酯苷B具有顯著的抗炎抑菌、抗氧化的作用[11-12]。因此將其作為連翹的指標性成分進行研究，補充完善藥典中連翹藥材的質量評價指標。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H CLASS超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CP214電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；H1650-W微量臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；2013QT超聲波清洗器（北京碳氫超聲波清洗機有限公司）。

1.2 試藥

連翹苷，連翹酯苷A，連翹酯苷B，槲皮素對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkp18012210，wkp19010907，wkp18100801，wkp19011509，純度≥98 %）；數批連翹（青翹）樣品采自湖北省十堰市鄖縣十字溝（批號：20180801， 20180802，20180803），經湖北中醫藥大學陳科力教授鑒定為正品；乙腈，甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），預柱（1.7 μm，VANGUARD）；以0.2 %的甲酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～15 min，90 %～70 %A；15～25 min ，70 %～30 % A；柱溫：35 ℃；流速：0.3 ml/min；在330 nm波長下測定連翹酯苷B和連翹酯苷A的含量，在277 nm波長下測定連翹苷含量，在254 nm波長下測定槲皮素含量。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品細粉（過3號篩，50目）約1 g，精密稱定，于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱定重量，浸漬過夜，超聲處理（250 W，40 kHz）25 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml置于干鍋中蒸至近干，加入0.5 g中性氧化鋁拌勻烘干，加在中性氧化鋁柱（100～120目，1 g，內徑為1～1.5 cm）上，用70 %乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50 %甲醇溶解，轉移至5 ml量瓶，并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素對照品，加70 %的甲醇制成每1 ml分別含0.42，0.92，0.51，0.49 mg混合對照品溶液，搖勻，低溫避光保存備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取連翹樣品，按照2.2項方法制成供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣分析，得到樣品的UPLC色譜圖。參照4個對照品的色譜行為及其DAD紫外檢測光譜圖，結果見圖1。在樣品色譜圖上對其峰進行指認，標定了4個成分，它們分別是圖1中連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷和槲皮素。

圖1 UPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察 為分析各藥材標定成分的含量分布，按如下方法研究了各標定成分的線性回歸分析參數：為分析各藥材標定成分的含量分布，按如下方法研究了各標定成分的線性回歸分析參數：精密吸取連翹酯苷B儲備液（0.42 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；連翹酯苷A儲備液（0.92 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；連翹苷儲備液（0.51 mg/ml）2，3，4，5，6 μl；槲皮素儲備液（0.49 mg/ml）0.2，1.4，2.6，3.8，5 μl，按2.1項下色譜條件進樣測定，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，各成分回歸方程分析參數見表1。結果表明連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷和槲皮素分別在進樣量為0.42～2.10，0.92～4.60，1.02～3.06，0.098～2.45 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

表1 4種成分線性關系考察試驗數據

2.4.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，分別記錄其保留時間和峰面積，結果表明峰面積的RSD分別為0.28 %，0.73 %，1.35 %和0.57 %，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液（批號20180801），分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄其峰面積并計算RSD，結果表明其RSD分別為0.61 %，0.93 %，1.57 %和1.74 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗 取同一批樣品（批號20180801），按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，并計算4種成分含量，其RSD分別為1.81 %，2.04 %，2.61 %和2.39 %，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的連翹粉末樣品（批號20180801）6份，各約1 g，精密稱定，分別精密加入15ml連翹酯苷B（0.42 mg/ml）、連翹酯苷A（0.92 mg/ml）、連翹苷（0.51 mg/ml）和7.65 ml槲皮素（0.49 mg/ml），按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表1。

表1 連翹中4種成分的加樣回收率試驗結果

2.5 樣品含量測定

精密稱取3批連翹樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件測定4種成分的含量，結果見表3。

表3 4種成分含量測定結果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

比較了超聲提取、加熱回流提取和過中性氧化鋁柱子提取3種提取方式，發現用第3種提取方式得到的色譜圖峰數較多，能同時檢測到4種成分，峰形較好，分離狀況令人滿意，故選擇過中性氧化鋁柱子的提取方式。

3.2 波長的選擇

用PDA檢測器對樣品在210～400 nm進行全波長掃描，發現連翹酯苷B和連翹酯苷A最大波長為330 nm，連翹苷和槲皮素分別在277 nm和254 nm波長下有最大吸收，分別在最大吸收波長下測定4種成分的含量。

3.3 流動相的選擇

分別考察了乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸為流動相時色譜峰的分離效果。結果，以乙腈-0.2 %甲酸溶液為流動相時分離效果最佳，色譜峰的分離度及峰形均良好，故最終選擇乙腈-0.2 %甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫。

3.4 UPLC與HPLC色譜的對比

對UPLC和HPLC的供試品色譜圖進行比較發現，UPLC具有更高的分離度、靈敏度和更快的分離速度，單位時間內能提供更多的信息量，同時更節省流動相。

本文采用UPLC法同時測定連翹藥材中4種成分含量，避免了單個成分測定帶來的繁瑣步驟，減少了流動相的配制和供試品的制備步驟，有效的提高了分析速度，縮短分析周期。該方法簡便、快捷、準確且靈敏度高，可為連翹質量評價的科學性和全面性提供一定的參考。