基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選制川烏單酯型生物堿醇提工藝

周長(zhǎng)凱，徐 文，高 靜，曹銘晨，紀(jì)洪艷，姚景春，張 娜，劉永軍，荊凡波*

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫(yī)院，山東 青島 266041；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 273400；4.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012）

川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，制川烏為川烏的炮制加工品，其味辛、苦，熱，有毒。歸心、肝、腎、脾經(jīng)，具祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效，具極高的藥用價(jià)值。現(xiàn)代研究證實(shí)，川烏具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛[1-4]等藥理作用，但因其毒性，川烏臨床應(yīng)用受極大限制。雙酯型生物堿為其川烏的主要毒性成分，經(jīng)炮制后，可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿，毒性為雙酯型生物堿的0.002～0.005[5-7]，在保持藥理活性的同時(shí)安全性得到極大提升，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前尚無(wú)制川烏提取物相關(guān)制劑，且對(duì)其單酯型生物堿的提取相關(guān)研究極為匱乏，本試驗(yàn)擬采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制川烏單酯型生物堿醇提工藝，以期為工業(yè)化大生產(chǎn)及新制劑研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器、藥品與試劑

API4000+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，Agilent 1290II高效液相色譜儀。苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰次烏頭原堿，苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品由上海一林生物科技有限公司提供。制川烏飲片購(gòu)自藥材市場(chǎng)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜分析條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm，上海月旭科技有限公司），柱溫40 ℃，流速：0.4 ml/min。流動(dòng)相：0.1 %甲酸水-甲醇=55:45。

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧電離離子源，源電壓5.5 kV，毛細(xì)管溫度為550 ℃，鞘氣流速40，正離子檢測(cè)，質(zhì)量分析器為四級(jí)桿，采用MRM模式檢測(cè)，檢測(cè)條件與MRM圖分別見(jiàn)表1、圖1。

表1 MRM條件表

圖1 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的MRM圖

2.3 供試品溶液的制備

取制川烏中粉10 g置于圓底燒瓶中，加75 %乙醇250 ml，加熱回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品各10 mg，分別置10 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別將苯甲酰新烏頭原堿（1 mg/ml）、苯甲酰次烏頭原堿（1 mg/ml）、苯甲酰烏頭原堿（1 mg/ml）溶液稀釋1000，2000，5000，10 000，20 000和50 000倍，依次注入液-質(zhì)色譜儀，記錄峰面積。分別以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，苯甲酰新烏頭原堿回歸方程為：Y=2.92×103X+1.31×102，r=0.9995；苯甲酰次烏頭原堿回歸方程為：Y=4.37×103X+1.55×102，r=0.9998；苯甲酰烏頭原堿回歸方程為：Y=1.12×103X-1.05×102，r=0.9996。結(jié)果表明, 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿在20～1000 ng范圍線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿峰面積RSD值分別為1.46 %，1.27 %，1.19 %，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的峰面積RSD值分別為1.14 %，1.35 %，1.27 %（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取10 μl進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得到供試品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量RSD值分別為1.26 %，1.32 %，1.13 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取9份已知含量的供試品，每份約1.00 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入3種對(duì)照品的量相當(dāng)于供試品中含各對(duì)照品量的80 %，100 %，120 %，每個(gè)水平平行3份。按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按2.1、2.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算單酯型生物堿含量（以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿之和計(jì)）、加樣回收率及RSD值，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，3種濃度的平均加樣回收率為100.9 %，101.5 %，101.9 %，RSD值為1.21 %，1.86 %，2.50 %。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 定量限與檢測(cè)限考察 取2.4項(xiàng)下的對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)的條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。以最低定量限和檢出限信噪比S/N=10和S/N=3為原則，計(jì)算定量限為與檢測(cè)限分別為0.0200，0.0065 μg/ml。

2.6 單因素試驗(yàn)

2.6.1 提取次數(shù)對(duì)單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過(guò)。殘?jiān)粎⒄盏谝淮蔚奶幚矸椒ǎ謩e提取2次。測(cè)定3個(gè)樣品中單酯型生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取次數(shù)單酯型生物堿含量

2.6.2 粉碎粒度對(duì)單酯型生物堿含量的影響 分別取制川烏飲片、粗粉、中粉、細(xì)粉各10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中單酯型生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同粉碎粒度單酯型生物堿含量

2.6.3 乙醇濃度對(duì)單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，分別加35 %，55 %，75 %，95 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中單酯型生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同乙醇濃度單酯型生物堿含量

2.6.4 乙醇倍量對(duì)單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，分別加75 %乙醇50，150，250，350，450 ml回流提取1 h，提取液定容至500 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中單酯型生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同乙醇倍量單酯型生物堿含量

2.6.5 提取時(shí)間對(duì)單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，分別回流提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取液定容至500 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中單酯型生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.7 正交試驗(yàn)

圖6 不同提取時(shí)間單酯型生物堿含量

2.7.1 正交試驗(yàn)表 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，提取2次已把目標(biāo)成分提取完全，第3次提取量?jī)H為前兩次總和的0.86 %，故固定提取次數(shù)為2次。粉碎粒度方面，細(xì)粉較中粉目標(biāo)成分含量升高僅0.93 %，綜合考慮生產(chǎn)可操作性與成本，選擇粒度為中粉。乙醇濃度方面，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高成分含量逐漸升高，至75 %時(shí)含量最高，此濃度下目標(biāo)成分溶解性高，95 %時(shí)含量出現(xiàn)顯著下降，故選擇鄰近濃度65 %，75 %，85 %為正交試驗(yàn)因素水平。溶劑倍量方面，隨提取體積增大成分含量逐漸升高，25倍量（250 ml）時(shí)已提取較充分，35，45倍時(shí)含量無(wú)明顯增加，故選擇15，25，35倍作為正交試驗(yàn)因素水平。提取時(shí)間方面，當(dāng)提取1.5 h時(shí)成分含量最高，提取較完全，2 h時(shí)開(kāi)始下降，長(zhǎng)時(shí)間加熱可能會(huì)使單酯型生物堿進(jìn)一步水解，故選擇1，1.5，2 h為正交試驗(yàn)因素水平。

表3 正交因素水平表

2.7.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，極差RA＞RC＞RB，即影響因素主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞乙醇倍量。從表5方差分析結(jié)果表明，對(duì)于目標(biāo)成分的提取，乙醇濃度影響顯著，提取時(shí)間和乙醇倍量有一定影響。根據(jù)k值進(jìn)行分析，得到最優(yōu)工藝為A2B2C3，但C3的單次提取時(shí)間為2 h，時(shí)間偏長(zhǎng)，且提取效果非顯著優(yōu)于C2水平，綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際、環(huán)保等因素，確定A2B2C2為最佳工藝，即乙醇濃度75 %，乙醇倍量25倍，每次提取1.5 h。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)

表5 方差分析表

2.8 工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證所得組合工藝的可行性，進(jìn)行了3批驗(yàn)證試驗(yàn)，按優(yōu)選工藝進(jìn)行提取，測(cè)定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿，結(jié)果見(jiàn)表6。可見(jiàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為12.87，RSD為1.91 % (n= 3)，表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的條件穩(wěn)定可行，可作為制川烏單酯型生物堿的提取工藝。

表6 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中藥川烏中二萜生物堿為其主要的化學(xué)成分，也是川烏的主要藥效成分，以 C-19二萜生物堿為主，包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等有毒的雙酯型生物堿，其經(jīng)過(guò)炮制可成為低毒的單酯型生物堿如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等，從而達(dá)到增效減毒的目的，使制川烏的臨床使用安全性得到極大提升，但是針對(duì)制川烏單酯型生物堿的提取、藥理及機(jī)制相關(guān)研究相對(duì)匱乏，以致市面上仍無(wú)制川烏提取物的相關(guān)制劑，因此未來(lái)制川烏新制劑的開(kāi)發(fā)創(chuàng)制具有廣闊的市場(chǎng)空間。

在正交試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)成分的選擇上，制川烏中主要含有單酯型生物堿，雙酯型生物堿含量相對(duì)較低，且2015年版中國(guó)藥典對(duì)烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿3種雙酯型生物堿含量之和設(shè)定上限不得過(guò)0.04 %，本試驗(yàn)參考藥典含量測(cè)定項(xiàng)，選取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿3種單酯型生物堿特征成分為指標(biāo)成分，以含量之和記為單酯型生物堿含量，作為工藝優(yōu)選的指標(biāo)。在提取方法上，我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在未調(diào)pH情況下，本研究所用醇提法較之藥典提取法，對(duì)指標(biāo)成分的提取率更高，醇提法亦更適于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，在提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分含量較低，且3種成分的含量相差很大，苯甲酰烏頭原堿含量極低，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)過(guò)未檢測(cè)出的情況，但在工藝優(yōu)選后，其含量較穩(wěn)定，優(yōu)化后提取工藝簡(jiǎn)單、可靠，對(duì)日后制川烏的深入開(kāi)發(fā)以及單酯型生物堿新制劑的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考意義。