NaCl處理谷子萌發期種子的轉錄組學分析

潘教文，李臻，王慶國，管延安，李小波, ，戴紹軍，丁國華，劉煒,3

NaCl處理谷子萌發期種子的轉錄組學分析

潘教文1，李臻1，王慶國1，管延安2,3，李小波1, 4，戴紹軍5，丁國華4，劉煒1,3

（1山東省農業科學院生物技術研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態重點實驗室，濟南 250100；2山東省農業科學院作物研究所/山東省特色作物工程實驗室，濟南 250100；3山東師范大學生命科學學院，濟南 250014；4哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025；5上海師范大學生命與環境科學學院/植物種質資源開發協同創新中心，上海 200234）

【】谷子具有抗旱、耐貧瘠的特性，逐漸成為研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期篩選并獲得的谷子耐鹽品種和敏感品種為材料，通過RNA-Seq測序篩選鑒定谷子的鹽脅迫響應基因，揭示其響應鹽害機制，為培育谷子抗鹽新種質提供理論依據。對14個谷子品種進行了萌發期抗鹽篩選。谷子不同品種的種子經150 mmol·L-1NaCl處理萌發培養7 d后，分別統計各品種種子的萌發率、根長和芽長，綜合各項指標鑒定到豫谷2為耐鹽品種、安04為鹽敏感品種。以這兩個品種鹽脅迫前、后萌發期種子為材料，應用RNA-Seq進行轉錄組測定，分析鑒定鹽害下差異表達基因（differentially expression gene，DEG），并對DEG進行GO和KEGG功能富集分析。同時應用qRT-PCR對隨機挑選的15個DEG表達模式進行驗證，并與RNA-Seq結果進行相關性分析。耐鹽品種豫谷2、鹽敏感品種安04種子經鹽脅迫處理后，分別鑒定出2 786個和4 413個DEG；其中，每個品種在NaCl處理前及處理后分別鑒定出1 470和3 826個DEG。GO和KEGG聚類分析顯示，NaCl處理下參與信號轉導、抗氧化、有機酸的合成及轉運以及次生代謝等相關的DEG在谷子萌發期種子應對鹽脅迫響應過程中具有關鍵性的作用，DEG主要集中在脅迫響應、離子的跨膜轉運、氧化還原、次生代謝及有機酸、多胺、苯丙烷的合成等過程。qRT-PCR對15個DEG表達模式的檢測結果與RNA-seq結果相關系數為0.8817。其中編碼離子通道的基因（）、過氧化物酶基因（）、黃烷酮-3-羥化酶基因（）、MYB轉錄因子基因等在豫谷2中表達量較高，顯示其在谷子萌發期種子響應鹽脅迫中可能發揮一定作用。谷子耐鹽品種及鹽敏感品種的種子對鹽脅迫的響應程度具有一定的差異性，且品種對鹽害的耐受能力主要與基因對脅迫的響應程度相關，而與DEG的數量相關性不大。

谷子；鹽脅迫；萌發期種子；轉錄組；分子機制

0 引言

【研究意義】鹽漬是灌溉農業面臨的嚴峻問題，嚴重影響了農作物的地理分布和產量。在世界范圍內，大約有800×106萬hm2的土地受到鹽漬的影響，而且每年增長率為1%—2%。鹽害可使植物產生滲透脅迫，進一步導致離子毒害，影響種子萌發、植物正常的生長發育和形態建成、光合作用，并產生次生傷害，造成物質代謝紊亂及過氧化物的積累，嚴重影響了作物的產量及品質[1-4]。谷子（L. Beauv.）又稱為粟，去皮后俗稱小米，是起源于中國的傳統優勢作物，也是糧飼兼用作物。其具有抗旱、耐瘠薄、C4高光效、生育期短，適應性廣等突出優勢[5-6]。不僅在目前旱作生態農業中有重要作用，在國民經濟中也具有重要地位。因此，以谷子為材料，鑒定抗鹽基因及其功能，研究基因作用機制，對作物的遺傳改良和抗鹽品種的培育具有重要意義。【前人研究進展】為了有效地應對鹽脅迫，植物在進化過程中形成了一系列參與感知滲透脅迫和離子毒害的機制。其中K+離子通道（high-affinity K+channel，HKT）、非選擇性陽離子通道（nonselective cation channel，NSCC）等[7]及胞內第二信使Ca2+在植物應對鹽脅迫過程中具有重要作用。部分鈣結合蛋白、激酶及轉錄因子等，也參與了脅迫信號的感知及傳遞[8]。已知谷子對鹽堿有一定的耐受性，研究表明在0.3%鹽堿以下的土壤，谷子可以較好地生長發育[9]。近年來，隨著谷子基因組測序的完成，谷子被認為是研究禾本科作物新的模式作物。在基因組水平上，各種不同的基因家族，以及干旱響應基因、蛋白及非編碼RNA等都被鑒定出來[10-14]。【本研究切入點】谷子抗旱性研究開展的較早，部分研究成果已應用到作物育種過程，并取得了較好的經濟及社會效益。例如，通過對谷子耐旱品種豫谷1和敏感品種安04轉錄組學分析，結合干旱相關的QTL，鑒定到20個谷子耐旱的關鍵基因[13]。通過miRNA測序結合降解組學分析，12個已知的miRNA家族及其56個靶基因被鑒定到，同時，9個新的miRNAs及其26個靶基因也被鑒定到[12]。利用定量蛋白質組學分析也鑒定到一系列的參與谷子干旱響應的蛋白[14]。谷子抗鹽研究起步較晚，其對鹽脅迫的響應及抗鹽機制仍有待深入挖掘?！緮M解決的關鍵問題】通過對不同谷子品種在萌發期進行耐鹽篩選，初步獲得鹽敏感品種安04和耐鹽品種豫谷2。本研究以NaCl處理前后這兩個品種為材料，利用RNA-seq進行轉錄組測序，結合數據分析及歸納，進而揭示谷子的耐鹽機制。為解析谷子的抗鹽機制及培育谷子抗鹽品種提供理論依據和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理方法

谷子品種濟谷11、濟谷12、濟谷14、濟谷15、濟8431、魯谷1號、魯谷2號、魯谷6號、魯谷8號、豫谷2、豫谷11、豫谷14均由山東省農業科學院作物研究所管延安老師課題組饋贈，豫谷1和安04由中國農業科學院作物研究所刁現民老師課題組饋贈。谷子的種子經10%的次氯酸鈉消毒后，于含有兩層濾紙的9 cm的無菌培養皿中萌發，分別用滅菌的ddH2O和150 mmol·L-1的NaCl處理，每個培養皿放100粒種子，設置3個生物學重復。種子在光照培養箱（白天14 h 30℃/黑暗10 h 25℃）中培養7 d后，統計萌發率、根長和芽長。之后將去掉胚根及胚芽的萌發期種子經液氮速凍，置于-80℃保存備用。

1.2 RNA文庫的構建和測序

萌發期種子總RNA用試劑盒（Total RNA Isolation Kit (China)）提取。具體步驟參照說明書。用RNA Nano 6000 Assay Kit of Bioanalyzer 2100 system （Agilent Technologies, CA, USA）檢測RNA的完整性。分別取3 μg的RNA，用試劑盒（NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina （NEB, USA））構建文庫。通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模板，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseⅠ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，每個樣品3次重復，最終獲得文庫。

構建完成的文庫經Qubit2.0 Fluorometer進行初步定量，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer進行檢測，并用qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量。

構建成功的文庫經Illumina測序，產生150 bp配對末端讀數。經對原始數據過濾，獲得高質量及可靠的數據。從基因組網站下載參考基因組和基因模型注釋文件，使用Hisat2 v2.0.5構建參考基因組的索引，并使用Hisat2 v2.0.5將配對末端過濾后的數據（clean reads）與參考基因組比對。根據基因的長度和比對到該基因的次數來估算每個基因的FPKM值。

利用DESeq2 R package（1.16.1）進行比較組合之間的差異表達分析（每組3次生物學重復）。使用Benjamini&Hochberg方法調整＜0.05，結合閾值（|Log2fold change|≥1）篩選每個比對組合的DEG。

通過clusterProfiler R軟件實現DEG的GO富集分析，其中修正了基因的長度偏差，考慮具有小于0.05校正值的GO通過DEG顯著富集。也利用clusterProfiler RKEGG軟件分析KEGG通路中DEG的系統富集情況。具體參考已報道的信息及相關數據庫進行基因的富集分析[13-17]。

1.3 qRT-PCR分析

隨機選取15個DEG，對它們在NaCl脅迫下豫谷2和安04中的表達模式進行驗證。以作為內參，基因特異引物見電子附表1。利用構建文庫的RNA反轉錄成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green (Roche) Master為熒光染料，進行qRT-PCR分析，反應體系為20 μl，SYBR Green Master 10 μl上游引物1 μl，下游引物1 μl，ddH2o反應條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。數據處理參考Zhang等[18]方法，利用Pearson’s correlation coefficient（PCC）計算2組數據的相關系數。

2 結果

2.1 NaCl處理豫谷2和安04萌發期種子的轉錄組分析

以150 mmol·L-1NaCl對14個谷子品種的耐鹽性進行篩選。表型觀察結合根長、芽長和萌發率分析，發現鹽脅迫處理7 d后，安04種子的相對萌發率、根長和芽長分別約為對照的20%、30%和31%，而豫谷2種子的相對萌發率、根長和芽長是對照的60%、70%和51%（圖1）。綜合各項指標，初步鑒定豫谷2為耐鹽品種，安04為鹽敏感品種（圖2-A）。

利用RNA-seq技術，對豫谷2及安04進行轉錄組測序。將鹽處理前后豫谷2樣品分別命名為YG2CKS和YG2NTS，將鹽處理前后安04的樣品分別命名為An04CKS和An04NTS。結果顯示，豫谷2鹽處理前后（YG2NTS vs YG2CKS）共鑒定到DEG為2 786個，其中上調基因有1 410個，下調基因有1 376個（電子附表2）。安04鹽處理前后（An04NTS vs An04CKS）共鑒定到DEG為4 413個，其中上調基因2 241個，下調基因2 172個（電子附表3）。未經鹽處理的2個品種間（YG2CKS vs An04CKS）有DEG為1 470個，其中上調基因540個，下調基因930個（電子附表4）。鹽處理后2個品種間（YG2NTS vs An04NTS）共有DEG為3 826個，其中上調基因1 521個，下調基因2 305個（圖2-B）（電子附表5）。韋恩圖分析顯示，鹽脅迫處理后豫谷2和安04中共同的DEG為1 278個（圖2-C），鹽脅迫處理前后豫谷2和安04 2個品種間存在882個共有DEG（圖2-C）。

2.2 部分DEG表達模式的qRT-PCR分析

qRT-PCR結果顯示，15個隨機挑取的DEG在NaCl處理后的安04和豫谷2中的表達模式，除存在差異，其他基因變化趨勢基本與RNA-seq結果一致，結果間相關系數為0.8817，具有很好的相關性。表明RNA-Seq結果準確、可信。

圖1 經150 mmol·L-1 NaCl處理14個谷子品種種子的相對萌發率（A）、相對根長（B）和相對芽長（C）分析

A：150 mmol·L-1 NaCl處理7 d后豫谷2和安04幼苗的表型；B：不同比較組合的DEG統計；C：不同比較組合DEG韋恩圖

R值代表RNA-seq和qRT-PCR結果的相關系數 R value indicates the correlation coefficient between data of RNA-seq and qRT-PCR

2.3 DEG功能富集分析

通過對不同比較組鑒定到的DEG進行GO和KEGG代謝途徑富集分析。GO富集分析主要分為生物學過程、細胞組分和分子功能3個亞類。DEG主要富集在代謝、細胞學過程、生物調節和刺激響應等生物學過程；DEG主要富集在細胞、細胞膜和細胞器等細胞組分中；DEG主要具有催化、結合和轉運的功能（圖4）。進一步分析發現，鹽脅迫后豫谷2（YG2NTS vs YG2CKS）上調的DEG主要富集在幾丁質代謝（GO：0006030）、細胞壁大分子代謝（GO：0044036）、氧化還原（GO：0055114）、多胺代謝（GO：0006595）等過程（電子附表6）。而鹽脅迫后安04上調的DEG主要富集在脂肪酸代謝（GO：0006631）、氧化還原（GO：0055114）、有機酸代謝（GO：0006082）等過程（電子附表7）。鹽處理后豫谷2下調的DEG主要富集在跨膜運輸（GO：0055085）、生物學過程（GO：0008150）、和激素響應（GO：0009725）等過程（電子附表6），而安04下調的DEG主要富集在蛋白磷酸化（GO：0006468）、初級代謝（GO：0044238)和跨膜運輸（GO：0055085）等（電子附表7）。鑒于2個品種間的比較能較直接的反應不同品種之間的差異，故對未處理的豫谷2和安04的轉錄組數據進行了比較（YG2CKS vs An04CKS），結果顯示，相對于安04，豫谷2中的基因主要參與各種物質轉運過程，如氨基酸跨膜運輸（GO：0003333）、離子跨膜轉運（GO：0098656）、有機酸跨膜運輸（GO：1903825）、和戊糖代謝（GO：0019321）等過程。而安04中的DEG主要富集在細胞碳水化合物生物合成（GO：0034637）（電子附表8）。而鹽處理后不同品種間DEG可體現品種對鹽脅迫響應的差異，對比顯示（YG2NTS vs An04NTS），鹽脅迫下豫谷2中上調的DEG主要富集在幾丁質代謝（GO：0006030）、脅迫響應（GO：0080134）、離子轉運（GO：0006811）和有機酸生物合成（GO：0016053）（電子附表9）。

KEGG富集分析發現，鹽脅迫后，豫谷2和安04上調DEG主要富集在精氨酸及脯氨酸代謝、次生代謝物合成、植物激素信號轉導、淀粉及糖代謝等途徑，顯示以上途徑可能參與鹽脅迫響應（圖5、電子附表10和電子附表11）。而下調的DEG主要富集在類苯基丙烷合成、甘油磷脂代謝、氨基酸合成等代謝途徑（電子附表10和電子附表11）。品種間的比較顯示，鹽脅迫處理前（YG2CKS vs An04CKS），即豫谷2中主要富集次生代謝物合成途徑，顯示該品種本身次生代謝物的合成及含量應高于安04；而鹽處理后，各品種上調的DEG顯示不同品種對鹽脅迫響應情況的不同，其中豫谷2中參與次生代謝、谷胱甘肽代謝及類苯基丙烷合成等途徑的DEG明顯多于安04，顯示這些途徑可能參與鹽害響應，并對豫谷2抗鹽性的形成具有一定作用（電子附表12和電子附表13）。

2.4 部分關鍵DEG分析

對2個谷子品種鹽處理前（YG2CKS vs An04CKS）后（YG2NTS vs An04NTS）DEG分析發現，其主要富集在脅迫相關的GO注釋和KEGG途徑，可能對谷子抗鹽響應及豫谷2品種抗鹽性的形成具有重要作用。

鹽脅迫處理后有3個編碼鈣結合蛋白基因（calcium- binding protein，，Seita.3G039700、Seita.8G176000和Seita.4G251700）及3個編碼蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，，Seita.3G380200、Seita.9G411700和Seita.8G171900）基因在豫谷2中表達量升高（電子附表14）。編碼信號轉導相關的類受體蛋白激酶（receptor-like serine/threonine-protein kinase，）基因和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，）基因也在豫谷2中具有較高的表達量。顯示豫谷2對脅迫信號響應更為迅速。同時，編碼離子通道的基因如（potassium transporter、Seita.7G082300和Seita. 5G439500）和（cation transporter，Seita.5G192900和Seita.5G024400）在豫谷2中也表現出明顯的鹽誘導表達模式（電子附表14）。

鹽脅迫導致植物體內活性氧ROS的積累，過量ROS的清除對于植物脅迫抗性非常重要。比對發現，編碼活性氧清除酶類和抗氧化蛋白相關的基因如、和硫氧還蛋白基因的表達在豫谷2中高于安04。同時，抗壞血酸-谷胱甘肽循環（AsA-GSH）的組分，如和的表達在鹽脅迫后的豫谷2中也有著較高的表達量（電子附表14），顯示豫谷2具有強于安04的ROS清除能力。

鹽脅迫抑制植物的生長主要通過抑制部分代謝過程及合成一系列具有保護作用的蛋白質和次生代謝物[1]。其中編碼多胺合成途徑的催化蛋白基因如：精胺合酶（spermine synthase）、多胺氧化酶（polyamine oxidase）、S-腺苷蛋氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase）以及氨基酸合成酶基因如：谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，）和脯氨酸合成酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase，）在鹽脅迫后的2個品種中的表達都明顯上調。參與蘋果酸代謝的蘋果酸合酶（malate synthase，Seita.7G144600）在安04中表達上調，而蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，Seita.3G137700和Seita.6G251800）在豫谷2中表達上調（電子附表13），對蘋果酸的積累具有促進作用。類黃酮是植物體內普遍存在的次生代謝物，在植物的生長發育和脅迫響應過程中起著重要的作用[19]。有5個參與類黃酮代謝的基因在鹽脅迫后豫谷2中的表達明顯高于安04，特別是麥黃酮合酶（tricin synthase）和黃烷酮加氧酶（flavanone 3-dioxygenase）基因，在未經鹽處理的豫谷2中表達就明顯高于安04（電子附表13）。有12個編碼P450的DEGs在YG2NTS vs An04NTS中表達明顯上調，同時也發現有5個P450基因在2個品種中的表達都受到鹽脅迫誘導。3-酮酰輔酶A合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）是長鏈脂肪酸合成的關鍵酶，有9個編碼的基因在安04中表達明顯上調，且鹽脅迫前后這些基因的表達均明顯高于豫谷2。β-葡萄糖苷酶可以水解纖維素并釋放游離的葡萄糖和相應配基，為胚芽生長提供碳源。21個編碼β-葡萄糖苷酶在安04中表達明顯上調，其中有5個基因（Seita.1G033600、Seita.9G528700、Seita.4G134400、Seita.9G279900和Seita.1G335300）在鹽脅迫處理前后的安04中的表達都高于豫谷2（電子附表14），顯示安04具有較高的基礎代謝水平。

圖4 DEG的GO分析

圖5 鹽脅迫處理后豫谷2和安04上調DEG KEGG富集分析前20個代謝途徑的散點圖

病程相關蛋白（pathogenesis-related family proteins，PR）是一類高度保守的蛋白家族，主要參與植物抗病反應，在非生物脅迫響應過程中也起著重要的作用[20]。8個PR基因在鹽脅迫處理前后的豫谷2中表達都高于安04，5個編碼內切幾丁質酶（endochitinase A，）基因在鹽脅迫后2個品種中的表達都明顯上調，且在鹽脅迫后豫谷2中的表達明顯高于安04。同時8個胚胎晚期發育蛋白基因（late embryogenesis abundant protein，）、6個非特異脂質轉運蛋白（non-specific lipid transfer protein，）和2個滲調蛋白（osmotin）的表達在2個品種中都明顯上調（電子附表14）。

赤霉素（gibberellin，GA）是植物體內重要的激素，在打破種子休眠，種子萌發及各個生命階段都發揮重要的作用。植物可通過赤霉素減少的方式使生長減緩從而適應外界環境[21]。GA2氧化酶（gibberellin 2-beta-dioxygenase，GA2ox）是GA降解過程的關鍵酶，2個編碼GA2ox的基因（Seita.4G015700和Seita.5G147400）分別在安04和豫谷2中上調表達。GA20氧化酶（gibberellin 20 oxidase，GA20ox）是GA合成途徑最后一步的關鍵酶，鹽處理下2個品種中編碼GA20ox 的基因（Seita.5G404900）的表達均上調，但在豫谷2中上調幅度明顯低于安04（電子附表14）。參與細胞分裂素的合成的基因（adenylate isopentenyltransferase 3，Seita.J000400）鹽脅迫后在安04中的表達明顯下調，但在豫谷2中下調并不明顯。4個生長素響應基因的表達在脅迫后豫谷2中的表達高于脅迫后安04中的表達（電子附表14）。顯示在鹽脅迫后耐鹽品種還能合成一定水平的細胞分裂素和生長素來維持谷子的生長發育。

鹽脅迫下，一系列差異響應的轉錄因子在豫谷2和安04中被鑒定出來。5個MYB轉錄因子在NaCl脅迫后表達上調，而這些基因的表達卻在安04中被抑制。其他脅迫響應的轉錄因子，如3個bHLH、5個NAC和12個WRKY轉錄因子在NaCl處理后的豫谷2中的表達明顯高于脅迫后的安04（電子附表14）。顯示NaCl脅迫下脅迫相關的轉錄因子在耐鹽品種豫谷2中的響應與敏感品種安04相比更為強烈。

3 討論

鹽漬作為主要的非生物脅迫嚴重威脅了作物產量和糧食安全，利用現代的各種分子生物學技術闡明作物的耐鹽機制，對篩選抗鹽品種，培育耐鹽新種質具有重要意義。對多種作物耐鹽性的研究已有一定報道。研究表明，植物在不同的發育期對鹽脅迫的抗性及敏感程度不同。種子萌發期被認為是植物生活周期中最重要和最脆弱的階段，在棉花、水稻、甜菜和番茄中研究表明，種子的萌發期和幼苗期是植物的鹽敏感期，也是進行植物耐鹽性篩選的關鍵期[22-23]。鑒于圍繞谷子鹽害響應的研究較少，本研究對14個谷子品種萌發期種子耐鹽性進行了篩選，鑒定到耐鹽品種豫谷2和鹽敏感品種安04，并對這兩個品種在萌發期的種子進行了轉錄組分析。本研究對于谷子耐鹽品種的篩選提供了鑒定依據，也為下一步揭示谷子的耐鹽機制提供了重要線索，為指導農業生產提供了理論依據。

3.1 不同品種間差異表達基因影響并決定品種的特性

作物或品種自身特性在影響其對外界的響應中具有決定作用。已知鹽芥（）作為擬南芥的一個近緣屬，屬于鹽生植物，極端耐鹽[24]。在正常生長條件下，鹽芥與擬南芥間就存在較多的差異基因，雖然在鹽處理后鹽芥與擬南芥中都會有不同的脅迫響應基因的表達發生改變并參與鹽害響應，但脅迫響應基因的數量較少[24-25]，綜上顯示不同材料之間基因的差異在決定材料間不同特性中發揮決定性作用。本研究中，對鹽處理前后豫谷2及安04中的DEG的GO和KEGG分析，顯示正常生長的豫谷2中參與各種物質（如氨基酸，離子，有機酸等）跨膜轉運和次生代謝的基因的表達高于安04。經鹽脅迫處理后（YG2NTS vs An04NTS），豫谷2中上調表達的基因也主要富集在脅迫響應、離子轉運、次生代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙烷合成等途徑，說明豫谷2中具有一定數量的脅迫誘導基因，且其在鹽害下的表達高于安04，表現為脅迫下豫谷2中相應物質的積累更為明顯，其在豫谷2抗鹽特性中具有一定的作用。鑒于品種間DEG數量較多，多于脅迫下誘導表達的基因數量，結合品種特性的不同，故品種自身的基因在影響并決定品種特性中具有重要作用。

3.2 有機酸參與谷子耐鹽性的形成

部分脅迫誘導基因在谷子抗脅迫品質的形成中發揮作用。有機酸在植物初級代謝中起著重要的作用，如三羧酸循環，主要包括蘋果酸，檸檬酸和延胡索酸等。這些物質在能量產生、氨基酸的合成、pH的調節、響應生物和非生物脅迫過程中起著關鍵作用[26]。本研究顯示，未經處理的品種間，抗鹽品種豫谷2 中特有的基因主要富集在有機酸轉運的生物過程，經鹽處理后（YG2NTS vs An04NTS），豫谷2中上調的基因同樣富集在有機酸的生物合成途徑中，蘋果酸合酶和蘋果酸脫氫酶都受到鹽脅迫的誘導。顯示有機酸的迅速合成和轉運將有助于豫谷2鹽脅迫抗性的提高。

3.3 PR基因的高表達調控谷子的耐鹽性

PR蛋白主要參與植物的抗病反應，過表達PR蛋白基因能增強植物對病原菌的抗性，其在適應非生物脅迫中也有多重作用[20]。煙草中過表達PR1蛋白能提高其對重金屬的耐性[20]。水稻中過表達不但可增強植物對稻瘟病的抗性，而且還可增強其對鹽漬和干旱脅迫的抗性[20]。幾丁質酶作為PR蛋白，在煙草中過表達哈茨木霉（）誘導的幾丁質酶能增強轉基因材料對生物脅迫和非生物脅迫（鹽漬和重金屬）的耐性[27]。冬黑麥冷脅迫誘導的和編碼具有抗凍活性的幾丁質酶，其在大腸桿菌中表達可提高受體菌株的抗凍性[28]。本研究中，顯示8個PR蛋白和5個幾丁質酶基因在豫谷2中高表達，綜合基因特性，推測以上DEG可參與谷子抗鹽特性的形成。

3.4 其他

谷子抗鹽性的形成還需要多種物質及過程的協同作用。其中細胞色素P450屬于單加氧酶超家族，具有廣泛的催化活性，可參與各種生物合成及降解途徑[29-30]。而植物激素如赤霉素激素，其含量的減少可使植物生長減緩從而適應外界環境[21]。本研究中，鑒定到多個P450基因的表達變化，部分赤霉素降解途徑及合成途徑中關鍵酶也發生了變化。同時部分介導植物生長發育和脅迫響應的轉錄因子的表達也都發生了改變[31]，最終影響了鹽害下谷子不同品種的抗鹽能力。

3.5 谷子萌發期種子對鹽脅迫的響應

本研究通過對鹽脅迫下谷子抗性的篩選，獲得了一個耐鹽品種豫谷2和敏感品種安04，初步明確了谷子萌發期種子對鹽脅迫響應的作用途徑及機制。鹽脅迫誘導谷子胞內鈣離子濃度的提高，進而其作為第二信使啟動一系列的信號轉導途徑，調控下游基因表達，通過合成、積累一系列的保護性蛋白，如LEA蛋白、PR蛋白、活性氧清除酶類等從而提高谷子的脅迫抗性。同時脅迫下部分初級代謝物（如有機酸，各種氨基酸等）和次生代謝物（如類黃酮，不飽和脂肪酸，多胺等）的積累還可保護細胞免受滲透脅迫及離子毒害，進而提高植物抗性（圖6）。耐鹽品種豫谷2與敏感品種安04相比，能迅速的感知鹽脅迫信號并向下游傳遞，通過對不同轉錄因子進行表達調控影響下游脅迫響應基因如、、和活性氧清除酶等基因的表達；有機酸、類黃酮類等代謝物的迅速合成及積累都有助于增強豫谷2的耐鹽性。該方面工作為下一步篩選谷子抗鹽品種、改良和培育谷子抗鹽新種質奠定基礎。

4 結論

豫谷2在萌發期的耐鹽性明顯高于安04。豫谷2中離子跨膜轉運、抗氧化、次生代謝、有機酸的合成及轉運等相關基因的表達明顯高于安04，這些基因的差異表達導致了2個品種的耐鹽性差異。

圖6 谷子萌發期種子鹽脅迫響應的模式圖

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Transcriptomics Analysis of NaCl Response in Foxtail Millet (L.)seeds at germination stage

PAN JiaoWen1, LI Zhen1, WANG QingGuo1, Guan YanAn2, 3, LI XiaoBo1,4, DAI ShaoJun5, DING GuoHua4, LIU Wei1, 3

(1Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100;2Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong engineering laboratory for featured crops, Jinan 250100;3College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014;4School of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025;5College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University/Development Center of Plant Germplasm Resources, Shanghai 200234)

Foxtail millet (L.) remarkably adapts to adverse ecologies, including drought, barren regions and high soil salinity. These characteristics promote it as a very promising model crop for exploring basic biology processes of plants. Unveil of mechanisms of foxtail millet under salinity is of immense significance.In this research, 14 millet varieties at germination stage were used for resistance screening under 150 mmol·L-1NaCl. The germination rate, root and bud length of each variety were measured after been treated for 7 d, and the salt tolerance variety Yugu 2 and salt susceptible variety An 04 were obtained. These two varieties before and after salt treatment were used for transcriptomes analysis by RNA-seq sequencing. The functional and pathway enrichments of differentially expressed genes (DEGs) were also performed by GO and KEGG analysis. Fifteen DEGs were randomly selected for further qRT-PCR analysis to verify the RNA-seq data.Totally 2 786 and 4 413DEGs were identified in Yugu 2 and An 04, and there were 1 470 and 3 826 DEGs within each cultivar before and after salt treatment, respectively. GO and KEGG enrichment analysis suggested that DEGs were mainly clustered into signaling, antioxidant system, organic acid biosynthesis and transport, and secondary metabolism, and the DEGs participated in response to stress, iontransmembrane transport, redox homeostasis, secondary metabolism, organic acid, polyamine and phenylpropanoid biosynthetic process. The qRT-PCR results showed high correlation coefficient of 0.8817 with the data of RNA-seq. Especially the genes such as cation transporter (), peroxidase (), flavanone 3-dioxygenase () and MYB transcription factors, which displayed higher vary degrees in Yugu2 under salinity may play key roles in salt response process of foxtail millet.There was difference in the response degree of salt tolerance variety and salt sensitive variety of millet under salinity. Moreover, the resistance trait formation and function to salt was mainly depends on the response degree instead of the number of DEGs under stress.

foxtail millet (L.); salt stress; seeds of germination stage; transcriptomics; molecular mechanisms

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.003

2019-07-19；

2019-09-30

山東省自然科學基金青年基金（ZR2019QC003）、現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-06）、山東省農業科學院重大科技成果培育計劃（2015CGPY10）、山東省農業科學院農業科技創新工程（CXGC2018E13）、山東省農業科學院青年英才計劃（2016-2018）

潘教文，E-mail：jwpan01@126.com。通信作者劉煒，E-mail：wheiliu@163.com

（責任編輯 李莉）