色譜技術在藥物分析中的應用

賀英 張嬌嬌 趙珺睿

天津紅日藥業股份有限公司 天津 3017 00

1 色譜技術概述

色譜分析是根據固定相和流動相分配系數的差異對物質進行分離和分析。在液相色譜、氣相色譜和超臨界液相色譜中都可以發現流動相的分子聚集狀態。根據分離原理可分為吸附、分布、空間封閉、離子交換、親和性色譜。按操作原理可分為柱層析法和平板層析法，色譜分析法已成為藥典中最常用的分析方法之一。根據實際情況，使用簡單、準確、經濟有效的儀器是必要的。隨著社會的發展，對不同藥物的檢測有很多不同的方法。不同的研究機構或監測部門有不同的檢測標準和要求。通過把高效液相色譜法與不同儀器相結合，使其能夠相互補充，進而達到一致和實用的目的[1]。

2 常用色譜技術

2.1 高效液相色譜技術

在現代化學中，色譜法是一種廣泛應用的以揮發性為主的分析分離技術。高效液相色譜法（HPLC）已成為一種更加實用有效的方法，其成為化學物質分析和檢測的重要方法。盡管這一方法適用性強、效率高，但也不是萬能的，比如其檢測器靈敏度就不如氣相色譜，不能滿足對痕量物質的分析，比如在藥物研發中對基因毒性雜質的控制，單采用高效液相色譜法很難滿足檢測要求。另外其柱外效應，容易使色譜峰變寬，降低分離效率。

2.2 毛細管電泳色譜技術

毛細管電泳色譜法是1980年初開發的一種分離技術，它將傳統的電泳技術與色譜法技術結合起來，具有操作方便、分離方法多樣性等優勢。基本原則是分離物質分解成充電離子或粒子，并根據不同的運動或分布因素按電場的作用將其分離到毛細管中。近年來，毛細管電泳技術在醫療領域得到廣泛傳播和發展，許多國家利用毛細管電泳技術分離和測量藥物中的雜質和異構體[2]。

2.3 二維液相色譜技術

2.3.1 二維液相色譜技術概述

隨著現代藥學的發展，尤其是隨著生物技術的發展，一些復雜混合物的分離如分子肽和氨基酸等成分靠單一的色譜技術很難得到分離。二維液相色譜的出現，有效地促進了現代藥學中復雜組分分離的進一步發展，具有更高的分離效率。二維液相色譜（2D-LC）用于分析和檢測多種分離技術，通過把不同的色譜柱連接起來，從而使一級色譜中的非液相組在下一級二維色譜圖中能夠被分離出來。通過重復分離分析，直到所有部件分離。二維液相色譜是兩種分離方式的結合，是不同的一維液相色譜的結合，二維液相色譜可分為兩種模式：中心切割模式和二維液相色譜模式[3]。

2.3.2 二維液相色譜技術的模式

中心切割方式有選擇地將成分分為二維進行分離和檢測，從而有效地減少外部干擾，提高分離純度。完全轉移到第二維度進行分離。盡管存在干擾，但可獲得適用于復雜樣品分離和檢測的所有成分的進一步信息。與一維分離檢測相比，這一檢測在極大程度上，能夠提升樣品分離的純度，進而防止外界的干擾，簡化濃縮和清洗過程，降低樣品風險。然而，分離檢測過程中的損失和污染仍然很大，因此更需要更換分離單元。

通常情況下，對于二維液相色譜而言，往往使用兩支或多支色譜柱，再者，根據柱結合技術，進一步完成樣品的柱間切換。一般而言，柱切換分為部分和整體兩種。這種劃分主要是根據切割組分來進行，根據其是否直接進入二維中，然而，二維分離可分為離線和在線。對于以往的中心切割技術，首先是在容器中收集一維洗脫產物，然后進樣到第二維中。現階段，隨著社會的進步以及經濟水平的不斷提升，相應的儀器也得到快速的發展，以便能夠有效適應自動化分離的需要[4]。

2.4 液相色譜-核磁共振聯用技術

對于核磁共振而言，其獲得有機物詳細結構信息的有力手段，在極大程度上，可以提供不同分子間的細微差別，然而，核磁共振主要是分析樣品是否為純物質，如果對混合物加以研究，往往是比較有難度的。基于這一現狀，在運用核磁共桭時，應該對混合樣品進行分離，以便達到顯著的效果。液相色譜-核磁共振技術始于上世紀80年代，是近年來才發展起來的一項技術。液相色譜-核磁共振技術主要應用于然產物的分析及藥物的代謝研究，但其普及度不高，在實際運用中還存在著一些不足，比如NMR檢測靈敏度不夠高，液相色譜中流動相中的質子對NMR的干擾等問題。相信今后隨著技術的發展，色譜-核磁共振連用技術會有質的發展，在藥物分析領域發揮更大的作用，通過參考文章《液相色譜-核磁共振連用技術發展狀況》得出。

2.5 分子生物色譜技術

這一技術具有重現性好、分析速度快、具有藥理學意義等特點，適用于中藥藥效物質基礎的篩選研究。

2.5.1 血漿蛋白

血漿蛋白能與藥物發生可逆結合成為“血漿蛋白-藥物復合物”，到達作用部位發生藥理作用。將血漿蛋白固載于載體上作為生物色譜填料，形成一種可以模擬體內環境中藥物與血漿蛋白間相互作用的色譜系統，由于不同的藥物分子與血漿蛋白的結合率具有差異，它在固定相的保留行為也不同，結合色譜技術中的各種參數計算，一方面可以篩選中藥中的活性物質，還能進行藥物與血漿蛋白的作用關系的研究[6]。

2.5.2 受體類

受體是一類功能蛋白，是藥物發揮作用的主要靶點，通過受體特異性地識別、結合，通過信息傳導從而參與生理調控、神經傳導等多種機體生理病理過程。若將受體固載于固定相表面，把其特異性結合作用與色譜分離技術結合，就能建立一種快速篩選藥效物質的方法，在此色譜柱中可保留能與受體特異性結合的中藥活性組分，而無保留行為的物質流出，活性篩選和色譜分離兩種模式可同時進行。基于高親和力固定化受體的色譜法有望成為確認藥物靶標和藥物受體相互作用分析的替代方法。

2.5.3 DNA

DNA是很多藥物的作用靶點如抗菌、抗腫瘤、抗病毒等，藥物小分子可與DNA通過嵌插作用、溝槽結合、靜電結合、長距組裝等相結合，由于溝槽結合和嵌插不會影響DNA的結構而影響其活性，因此DNA通過上述方式構建MBC，以此篩選天然產物中的活性物質。Su等以小牛胸腺DNA為固定相，作為一維色譜分離黃連、黃柏和苦參中的活性成分，而為二維色譜ODS柱色譜-質譜系統，對一維色譜的粗產物進行分離分析鑒定，實現了中藥復雜樣品的高效分離和活性成分篩選鑒定一體化流程[7]。

3 結語

色譜技術在醫藥產品的檢測和分離中起著非常重要的作用。在藥品的實際檢測中，應根據樣品的種類、純度要求和分離的需要，選擇合適的分離技術和類型[8]。