仙靈脾配伍雷公藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的減毒增效研究

杜星海 鄒小明 蔡田恬 阮 菲

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤（TriPtergium wilf ordii Hook.F）的根，性苦味寒，有大毒，歸心、肝經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒之功效[1]，雷公藤及其制劑作為免疫抑制藥物廣泛運(yùn)用于臨床，其中生殖系統(tǒng)的損傷是常見的臨床不良反應(yīng)之一。仙靈脾為小檗科植物箭葉淫羊藿［EPimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.］或淫羊藿（E.brevicornum Maxim.）的全草，具有補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨的功效[2]。臨床上，仙靈脾可與雷公藤配伍來降低雷公藤的毒副作用。本文就仙靈脾配伍雷公藤的減毒增效作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以探討其作用原理和機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級waster大鼠48只，雌性，體質(zhì)量180～220g，上海西普爾-本凱試驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障區(qū)，室溫調(diào)節(jié)在21～25℃，空氣流通，相對濕度50%左右。

1.2 藥品與試劑：雷公藤、仙靈脾飲片購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定為合格飲片，F(xiàn)reund’s完全佐劑（Sigma公司，10mg/ml BCG）；氯化鈉注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：20171108）；放免試劑盒卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）（sigma公司）。

1.3 儀器：足趾容積測量儀（山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站），AR80組織包埋機(jī)（MICROM），多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液的制備：取10g雷公藤，先煎煮1小時(shí)，然后加入不同比例的仙靈脾混合煎煮1小時(shí)，濾過，濾渣加水再煎煮1小時(shí)，合并濾液，濃縮至20ml，每ml提取液含雷公藤0.5g。仙靈脾高劑量組每ml含仙靈脾1.5g，仙靈脾中劑量組每ml含仙靈脾0.75g，仙靈脾低劑量組每ml含仙靈脾0.5g。

2.2 佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的制作：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字法分取8只作為正常組，右側(cè)足墊皮內(nèi)注射無菌生理鹽水0.1ml，其余大鼠右側(cè)足墊皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.1ml[3]。

2.3 分組與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為正常組、模型組、仙靈脾高劑量組、仙靈脾中劑量組、仙靈脾低劑量組和雷公藤組，每組各8只。于造模當(dāng)天按1.2ml/100g大鼠體質(zhì)量分組口服灌胃給藥，每天1次，正常組和模型組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)給藥21天。

2.4 觀察指標(biāo)與方法：各組大鼠每4天稱質(zhì)量一次，并用足跖容積測量儀測患側(cè)足跖容積，計(jì)算各組動(dòng)物足跖腫脹率；末次給藥后禁食不禁水12h以上，大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置后離心（3000r，10min）分離血清，ELESA法測血清中性激素E2、FSH、LH的值。解剖取出每只大鼠的脾臟、胸腺、子宮和卵巢，用濾紙吸去臟器表面的血液，用電子天平精密稱質(zhì)量，計(jì)算大鼠肝臟、脾臟和胸腺的臟器指數(shù)。計(jì)算公式為：大鼠臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。將大鼠子宮和踝關(guān)節(jié)用10%中性甲醛固定后行HE染色，觀察病理改變。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，模型組與空白組進(jìn)行兩兩配對的t檢驗(yàn)；模型組與各給藥組進(jìn)行方差分析，若方差齊性則采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Dunnet’s法檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量增長率（末次測量體質(zhì)量）：仙靈脾3個(gè)劑量組和雷公藤組的體質(zhì)量增長率均低于正常組（P＜0.05），但明顯高于模型組（P＜0.05）。見表1。

3.2 大鼠足跖容積腫脹率（末次測量數(shù)據(jù)）：仙靈脾3個(gè)劑量組和雷公藤組的足跖腫脹率均高于正常組（P＜0.05）；仙靈脾3個(gè)劑量組大鼠足跖腫脹率均小于模型組（P＜0.05）。見表2。

3.3 大鼠臟器指數(shù)：各組大鼠胸腺和子宮萎縮，肝臟、脾臟和腎臟腫大指數(shù)情況見表3。

表1 大鼠體質(zhì)量增長率數(shù)據(jù)（±s）

表1 大鼠體質(zhì)量增長率數(shù)據(jù)（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

例數(shù)組別正常組模型組雷公藤組仙靈脾高劑量組仙靈脾中劑量組仙靈脾低劑量組888888體重增長率15.52±2.91 1.21±4.20*5.62±3.41*#5.26±1.97*#5.43±2.16*#5.27±3.51*#

表2 大鼠足跖容積腫脹率（±s）

表2 大鼠足跖容積腫脹率（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

腫脹率2.13±4.09 99.26±13.58*72.25±27.21*#64.76±17.76*#77.88±4.17*#74.10±3.52*#例數(shù)組別正常組模型組雷公藤組仙靈脾高劑量組仙靈脾中劑量組仙靈脾低劑量組888888

表3 大鼠胸腺臟器指數(shù)（±s）

表3 大鼠胸腺臟器指數(shù)（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤組比較，△P＜0.05。

分組正常組模型組雷公藤仙靈脾高劑量組仙靈脾中劑量組仙靈脾低劑量組子宮指數(shù)0.142±0.058 0.094±0.010*0.101±0.017*0.135±0.017#△0.136±0.031#△0.115±0.020*例數(shù)888888胸腺指數(shù)0.215±0.012 0.184±0.09*0.189±0.018*0.204±0.013#0.194±0.009*0.191±0.012*肝臟指數(shù)3.779±0.664 4.242±0.156*4.253±0.181*4.142±0.175 3.941±0.168#△4.027±0.148*脾臟指數(shù)0.262±0.016 0.427±0.053*0.460±0.058*0.377±0.031*#△0.360±0.076*#△0.352±0.023*#△腎臟指數(shù)3.779±0.664 4.242±0.156*4.253±0.181*3.842±0.175#△3.941±0.168#△4.027±0.148

3.4 血清性激素：各組大鼠的E2、FSH和LH水平比較，見表4。

表4 大鼠血清性激素水平（±s，n=8）

表4 大鼠血清性激素水平（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤組比較，△P＜0.05。

分組正常組模型組雷公藤仙靈脾高劑量組仙靈脾中劑量組仙靈脾低劑量組E2（pg/L）41.70±2.89 27.96±1.25*36.20±1.89*#38.56±1.92*#△38.47±1.29*#△35.65±1.29*#FSH（mIU/L）9.02±0.23 6.51±0.67*8.05±0.26*#8.21±0.14*#7.97±0.21*#7.72±0.33*#LH（mIU/L）26.90±1.23 34.35±2.05*33.02±1.33*30.94±1.56#△31.61±0.68#31.64±1.02#

3.5 大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變（HE染色）：空白組大鼠踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，胞漿紅染，細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生，有大量炎性細(xì)胞侵潤，胞漿嗜酸性增強(qiáng)；雷公藤組、仙靈脾3個(gè)劑量組滑膜增生不明顯，偶見炎癥細(xì)胞侵潤，其中仙靈脾低劑量組滑膜增生明顯，有少量炎癥細(xì)胞侵潤，見圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化圖（HE×200）

3.6 大鼠子宮病理切片圖（HE染色）：正常組大鼠子宮結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；模型組子宮結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜上皮細(xì)胞水腫，局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列紊亂，部分脫落，黏膜下層可見淋巴細(xì)胞浸潤；雷公藤組子宮結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜上皮細(xì)胞輕度水腫，局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜下層淋巴細(xì)胞浸潤；仙靈脾高劑量組子宮結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜上皮細(xì)胞輕度水腫，局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生；仙靈脾中劑量組子宮結(jié)構(gòu)正常，局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞輕度水腫；仙靈脾低劑量組子宮結(jié)構(gòu)正常，局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞輕度水腫。見圖2。

圖2 各組大鼠子宮病理圖（HE×200）

4 討論

國內(nèi)外大量的研究及流行病學(xué)調(diào)查顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的患病人群中，女性遠(yuǎn)多于男性，男女比例為1∶3，圍絕經(jīng)期的女性發(fā)病率明顯高于同年齡男性[4]。臨床研究顯示雌激素在RA發(fā)病中起到及其重要的作用，而在自身免疫反應(yīng)中，雌激素可以增強(qiáng)體液免疫，而雄激素是天然的免疫抑制劑[5]。因此我們選擇雌性動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以體現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的廣泛性。

對于雷公藤應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療早在1980年就有報(bào)道，因其獨(dú)特的療效、無藥物的依賴性和停藥后無反跳現(xiàn)象等優(yōu)勢，近幾年又有大熱的趨勢。但隨著人類健康需求意識(shí)和對藥品安全性認(rèn)識(shí)水平的不斷提高，同時(shí)中藥不良反應(yīng)事件相關(guān)報(bào)道增多，雷公藤的臨床應(yīng)用始終受到其毒副作用限制[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，長期服用雷公藤易損傷人體陽氣，同時(shí)臨床研究表明，加強(qiáng)補(bǔ)腎能減輕雷公藤對雌性鼠生殖系統(tǒng)的毒副作用，并能保護(hù)卵巢功能[7]。仙靈脾主要成分為淫羊藿[8]，淫羊藿味辛、甘，性溫，功能補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，在補(bǔ)腎陽減低生殖系統(tǒng)毒副作用的同時(shí)，兼顧祛風(fēng)濕，一舉兩得，同時(shí)淫羊藿具有雌性激素樣的作用，能促進(jìn)雌性內(nèi)分泌系統(tǒng)，上調(diào)激素樣受體的表達(dá)，可以改善雌激素水平，減少由雷公藤引起的生殖系統(tǒng)的損傷。配伍減毒是一個(gè)很好的途徑，通過合理的配伍,可達(dá)到增效減毒的效果[9]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，仙靈脾配伍雷公藤在大鼠足跖容積腫脹率、大鼠各臟器指數(shù)上均較未配伍組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對大鼠血清性激素的檢測數(shù)據(jù)顯示配伍對激素控制體內(nèi)分泌水平有幫助，踝關(guān)節(jié)病理切片顯示滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤等程度較未配伍組明顯減輕。子宮病理切片顯示局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增生和水腫較未配伍組明顯輕微。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明仙靈脾配伍雷公藤對減少長期服用雷公藤引起的不良反應(yīng)有減毒作用，對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病亦有增效作用，由此可見，以中藥的有效組分進(jìn)行配伍是進(jìn)一步提高雷公藤制劑臨床使用效果的一條重要途徑。