T淋巴母細胞淋巴瘤/白血病患者PDL1蛋白/mRNA表達及其與臨床病理參數和預后的關系

潘歡，陳曉燕，張婷，洪鳴

T淋巴母細胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)是一種多見于兒童及青少年的血液疾病，是指不成熟前體T淋巴細胞經過轉化而產生的具有高度增殖性的惡性腫瘤，早期局限于淋巴組織，隨著病情惡化，T-LBL/ALL可逐漸擴散至骨髓[1-2]。報道顯示[3-4]，T-LBL/ALL在兒童白血病中占比為12%～15%，雖然當前的標準化化療方案可以使初治T-LBL/ALL患兒治愈率達到80%，但是對于部分高危患兒及多數成人患者，效果并不理想，尋找新的有效治療方案十分迫切。隨著對細胞免疫學的深入研究，程序性死亡配體1(PDL1)在腫瘤免疫治療中的應用也越來越廣。現分析PDL1蛋白/mRNA在T-LBL/ALL患者中的表達及其與臨床病理參數和預后的關系，以期為PDL1應用于T-LBL/ALL的治療提供依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本收集： 選擇 2016年1月—2018年12月江蘇省人民醫院血液內科三病區診治T-LBL/ALL患者50例(T-LBL/ALL組)的存檔病變組織蠟塊，蠟塊存檔前患者均未接受過放化療，患者均有完整臨床資料，且獲得3～36個月隨訪；另選擇淋巴結反應性增生(LH)患者35例存檔蠟塊作為對照組。

1.1.2 儀器與試劑： DM20000顯微鏡、石蠟切片機和烤片機(德國LEICA)，PCR擴增儀和反轉錄儀(美國ABI公司生產)，Biophotometer核酸蛋白定量測定儀、兔抗人PDL1單克隆抗體(北京中山金橋公司生產)，FFPE標本總RNA提取試劑盒(中國廈門AmoyDx公司生產)。

1.2 病變組織芯片制作 (1)提取T-LBL/ALL、LH患者存檔蠟塊，常規4 μm切片，進行HE染色。由經驗豐富的病理醫師在顯微鏡下確認腫瘤最明顯區域，并作標記，同時對標記切片對應蠟塊中的相應腫瘤區予以標記。(2)制作石蠟模塊，要求完成的石蠟模塊各個孔完整性良好，且模塊無裂痕。模塊做好后，將已標記的T-LBL/ALL、LH組織蠟塊按順序標記，進行組織穿刺和填充，用采樣針于標記區穿出組織條，并將組織條打入石蠟模塊中，初步完成組織芯塊。(3)將初步完成的組織芯塊倒置于載玻片上，平移置于烤箱中，60℃環境中烘烤7～8 min，拿出并待其自然冷卻，再放入60℃烤箱中烘烤7～8 min，循環5～6次，觀察到石蠟模塊與組織條基本融合后，標記組織芯塊反面并保存。(4)將所獲組織芯塊置于切片機上連續4 μm切片，使用蒸餾水展片后平放置烤片機內，65℃環境中烘烤20 min，最終制得T-LBL/ALL、LH組織芯片蠟塊。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 PDL1蛋白表達檢測：采用免疫組化法。將切好的T-LBL/ALL、LH組織芯片常規脫蠟水化后以PBS 液沖洗3次，5 min/次，高壓蒸汽進行抗原修復，加入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS液)沖洗后封閉，滴加相應的一抗50 μl至切片中，陰性對照組用PBS液代替一抗，靜置60 min。PBS液沖洗(3次，5 min/次)，滴加生物素標記的二抗50 μl，靜置10 min。PBS液沖洗3次，5min/次，之后滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察控制染色強度，蘇木素復染后自來水沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。由2位專業醫師分析結果，意見一致則為判斷有效，若不一致則請第3位醫師評價。PDL1主要在細胞膜中表達，細胞膜顏色為棕黃色判斷為陽性，陽性細胞百分率：0分，無染色；1分，陽性細胞百分率<5%；2分，陽性細胞百分率5%～9%；3分，陽性細胞百分率≥10%。0～1分為陰性，2～3分為陽性。

1.3.2 PDL1 mRNA表達檢測：采用實時熒光定量PCR檢測。將切好的T-LBL/ALL、LH組織芯片常規脫蠟水化后采用蒸餾水進行沖洗，刮片，根據試劑盒說明書提取RNA。依照逆轉錄試劑盒說明書配置預混液，單份體積為18 μl，加入模板RNA 2 μl，充分混勻后離心，獲取cDNA，置于4℃環境中保存。將引物配置成工作液后，再配置PCR擴增預混液，于PCR 擴增儀上擴增，反應條件：95℃環境下預變性20 s，再進行3 s循環變性40次，60℃環境下退火/延伸30 s，繪制溶解曲線。重復3次，得到對應CT值，取平均數。PDL1的mRNA表達水平以相對表達量來表示，以各組內基因表達量最低樣本為校準，ΔCT=目的基因CT-內參CT，相對表達量為2-(樣本ΔCT-組內基因表達量最低樣本ΔCT)。

1.3.3 臨床資料收集：收集T-LBL/ALL組患者臨床資料，包括性別、年齡、Ann Arbor分期、有無肝脾腫大、有無骨髓侵犯、有無B癥狀(無其他因素而發生體溫>38℃且持續時間>3 d，半年內體質量下降>10%，伴盜汗癥狀)、國際預后指數(IPI)(用于評估侵襲性淋巴瘤預后的指標，包括年齡、功能狀態、疾病分期、結外浸潤和血清乳酸脫氫酶水平等5個因素)、體力狀況ECOG評分。

2 結 果

2.1 2組PDL1蛋白及其mRNA表達比較 T-LBL/ALL組PDL1蛋白表達陽性率高于LH組(P<0.01)，PDL1 mRNA表達量高于LH組(P<0.01)，見表1。

表1 2組PDL1蛋白及其mRNA表達比較

2.2 PDL1表達與臨床病理參數的關系 T-LBL/ALL患者PDL1蛋白陽性、PDL1 mRNA表達量均與骨髓侵犯及IPI評分有關，其中有骨髓侵犯、IPI評分>2分的T-LBL/ALL患者PDL1蛋白表達陽性率、PDL1 mRNA表達量均明顯較高(P<0.05)，見表2。

2.3 PDL1表達與T-LBL/ALL患者預后的關系 Kaplan-Meier生存分析顯示，PDL1蛋白表達陽性者中位總生存時間(16.28個月)短于PDL1蛋白表達陰性者(19.21個月)(log-rank=9.761，P=0.002)。 PDL1 mRNA表達量與T-LBL/ALL總生存時間呈負相關(r=-0.718，P=0.000)。

3 討 論

T-LBL/ALL是一種惡性程度高的血液系統腫瘤，多見于男性，患者可出現淺表淋巴結腫大，并伴有縱隔腫塊及胸水，病情發展迅速且預后較差[5-6]。當前臨床治療以化療為主，雖然T-LBL/ALL患者總體生存率較以往有所提升，生存周期延長，但仍存在腫瘤復發、化療失敗等情況，且復發患者預后極差，故而尋找和T-LBL/ALL靶向治療及預后的相關指標具有重要價值。

研究顯示，T-LBL/ALL腫瘤細胞處于具有高度免疫抑制的微環境中，該環境中多種成分與腫瘤細胞不斷接觸，促使腫瘤細胞逃避自身免疫反應，不斷生長及增殖，具體機制可能與免疫抑制性細胞因子及介導負性共刺激信號有關[7-8]。PD1/PDL1為當前重要成熟免疫檢測點通路，PDL1是PD1重要配體，為B7家族跨膜分子，在造血細胞及腫瘤細胞表面含量較多，可抑制T淋巴細胞，并誘導免疫耐受，其與PDL1結合后，會增強T細胞線粒體內氧化反應，使得活性氧和過氧化氫水平升高，繼而抑制T細胞增殖，誘導其凋亡，削弱機體對腫瘤細胞的免疫應答，誘導免疫逃逸，在腫瘤發生及發展中起到重要作用[9-11]。研究指出[12-15]，乳腺癌、肺癌、胃癌等中PDL1均可呈現高表達，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、病理分級等相關。對腫瘤患者采用抗PD1/PDL1抗體類藥物，能夠有效抑制PD1/PDL1通路激活，增強機體對腫瘤細胞的免疫應答作用，阻斷腫瘤細胞免疫逃逸，恢復細胞毒性T淋巴細胞特異性殺傷功能，使患者自身免疫系統激活，殺死腫瘤細胞。Bertucci等[16]研究指出，對于侵襲性乳腺癌，可將PD1/PDL1作為其治療靶標，以延緩腫瘤復發，改善患者生存質量。當前國內對PDL1與T-LBL/ALL的相關研究較少，本研究分析PDL1在T-LBL/ALL患者中的表達情況，并以LH患者作為對照，顯示T-LBL/ALL組PDL1蛋白表達陽性率和 mRNA表達量均高于LH組，提示PDL1在T-LBL/ALL患者中呈高表達。Ansell等[17]研究亦表明，眾多淋巴細胞瘤均檢測到PDL1呈高表達，其表達水平可作為淋巴瘤患者預后指標。李義等[18]研究指出，淋巴瘤PDL1的高表達與腫瘤侵襲性具有關聯性，廣泛PDL1高表達可增強腫瘤增殖及侵襲特性。本研究分析PDL1蛋白及其mRNA表達量與臨床病理參數及預后的關系，顯示有骨髓侵犯IPI評分>2分的T-LBL/ALL患者PDL1蛋白表達陽性率和PDL1 mRNA表達量明顯較高，PDL1蛋白表達陽性患者總生存時間短于PDL1蛋白表達陰性患者，而PDL1 mRNA表達量與T-LBL/ALL總生存時間呈負相關，提示PDL1可能參與T-LBL/ALL的發生及發展，PDL1蛋白表達陽性和PDL1 mRNA表達量較高的患者預后更差。分析其作用機制，猜測可能是PDL1抑制T淋巴細胞增殖生長，并參與了不成熟前體T淋巴細胞發生異常轉化而產生惡性生物學行為的過程，且PDL1表達越顯著，腫瘤惡性程度越明顯。但關于其具體作用過程，因本次研究條件有限，未予以進一步探討，還需在后期研究中深入探討。

表2 50例T-LBL/ALL患者PDL1表達與臨床病理參數的關系

綜上，PDL1蛋白及其mRNA在T-LBL/ALL患者中均呈高表達，可能與T-LBL/ALL發生及發展有關，對T-LBL/ALL進展和預后評估具有重要作用，可考慮將PDL1蛋白及其mRNA作為T-LBL/ALL治療評價的重要切入點。