豬日本乙型腦炎及豬細(xì)小病毒復(fù)合PCR檢測方法的建立

呂玉金　吳鳳筍　劉勝利　李文剛

摘要：根據(jù)GenBank上登錄的日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）與豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）參考基因序列，設(shè)計(jì)合成2對特異性引物，在建立優(yōu)化單項(xiàng)PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，建立了PPV-JEV復(fù)合PCR檢測方法，可擴(kuò)增出預(yù)期的238 bp和152 bp特異性片段。該方法敏感性高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，臨床樣品檢測結(jié)果與單項(xiàng)PCR檢測結(jié)果符合率100%，該方法適合JEV和PPV的聯(lián)合檢測和鑒別診斷。

關(guān)鍵詞：豬;日本乙型腦炎病毒;細(xì)小病毒;復(fù)合PCR

中圖分類號：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0176-03

收稿日期：2018-07-20

基金項(xiàng)目：河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（編號：MXK2016102）。

作者簡介：呂玉金（1984—），女，河南商丘人，碩士，講師，主要從事動物傳染病發(fā)病機(jī)理及防制研究。E-mail：272166760@qq.com。

通信作者：李文剛，博士，教授，主要從事動物傳染病防控研究。E-mail：wengang-li@126.com。

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬病呈現(xiàn)多病原混合感染或繼發(fā)感染的現(xiàn)象[1]。流行性日本乙型腦炎（Japan eseencephalitis，JE）又叫日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種重要的人獸共患傳染病，豬群最易感，妊娠母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、高熱、死胎和木乃伊胎，公豬表現(xiàn)為睪丸炎，被世界衛(wèi)生組織列為需要重點(diǎn)控制的傳染病之一[2-3]。豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）引起的豬繁殖障礙性疾病，該病主要感染初產(chǎn)母豬，臨床表現(xiàn)為胎兒和胚胎的感染和死亡。血清學(xué)陰性的母豬主要在懷孕前半期通過口鼻感染病毒，病毒大量繁殖后可引發(fā)母豬的病毒血癥并且隨血液循環(huán)到達(dá)胎盤傳染給胎兒，形成垂直傳播[4]。該病在我國多發(fā)生于4—10月，豬感染后可終生帶毒，全場豬在短時間內(nèi)即可感染本病。豬在感染PPV后的1～6 d內(nèi)會出現(xiàn)病毒血癥現(xiàn)象，3～7 d內(nèi)即可經(jīng)糞便排毒，1周后可以檢測到相應(yīng)抗體[5]。母豬感染PPV后，病毒主要分布于機(jī)體內(nèi)一些快速增生的組織（例如淋巴結(jié)生發(fā)中心、結(jié)腸固有層、腎間質(zhì)等）[6]。研究表明，PPV僅會在活的豬胚胎中復(fù)制，感染胚胎一旦死亡就會被母體重吸收，病毒則無法在母體子宮內(nèi)傳播擴(kuò)散，若感染胚胎存活，則會在子宮內(nèi)傳播病毒，致使同窩的其他胎兒也發(fā)生感染[7]。

JEV、PPV感染都可造成母豬繁殖障礙性疾病，檢測這2種病毒有多種方法，包括病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)等，但都存在敏感性低、特異性差等缺陷[8]。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）因其特異性好，靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于各種病原的檢測，尤其是多重PCR，比常規(guī)PCR更高效，目前研究較多[9]。為快速鑒別診斷這2種病毒病，本研究旨在建立JEV-PPV復(fù)合PCR方法，并將該方法初步應(yīng)用于臨床樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

JEV疫苗株、PPV疫苗株及實(shí)驗(yàn)室保存的疑似感染JEV、PPV的病料。病料采取自河南某養(yǎng)豬場的疑似感染JEV、PPV病死豬的肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)等9份病料，每頭豬的各種組織混合為1份病毒。

1.2 主要試劑

Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶，購自上海生物工程公司;HipureViralRNASpinKit試劑盒、M-MLV H-First Sand Sythesis Kit試劑盒，購自Magen公司;DL500 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 病毒DNA的提取及檢測

應(yīng)用Sangon Biotech的Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒提取PPV病毒DNA，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行，其中溶液A在65 ℃預(yù)熱后沉淀溶解完全后使用，最后用100 μL經(jīng)65 ℃預(yù)熱的ddH2O洗脫。用超微量紫外分光光度計(jì)對所提取DNA的濃度進(jìn)行檢測。

1.3.2 病毒RNA的提取、檢測及反轉(zhuǎn)錄

采用Magen公司的HipureViralRNASpinKit試劑盒提取JEV的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行。Carrier RNA固體在使用前須用DEPC水溶解完全，濃度為1 μg/μL，注意分裝保存。另外，Buffer VHB、Buffer RW2用前必須用無水乙醇稀釋。最后采用100 μL DEPC水洗脫，并使用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度的測定。

然后利用Magen公司的M-MLV H-First Sand Sythesis Kit試劑盒將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取適量RNA溶液，依次加入適量RNA溶液、0ligo （dT）1 μL，dNTPs 1 μL，DEPC水補(bǔ)足至13 μL，經(jīng)過孵育冰上冷卻后，再加入5×First Stand Buffer 4 μL，0.1 M DTT 1 μL，M-MLV RNase HRT 1 μL，RNase Ihibior（40 U/μL）1 μL，離心，反應(yīng)45 ℃ 30 min，85 ℃ 10 s后瞬離，將產(chǎn)物立即放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank公布的PPV和JEV的全基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)、選擇引物，并對其特異性進(jìn)行鑒定，均具有良好的特異性。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

1.3.4 單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系的建立 單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系見表2。

94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，梯度退火溫度（49.5、507、52.9、54.1、55.4、57.8、587、59.9 ℃）下30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳退火溫度。

1.3.5 復(fù)合PCR反應(yīng)體系的建立

在單項(xiàng)PCR的基礎(chǔ)上，建立多重PCR反應(yīng)體系（表3）。

94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，梯度退火溫度（49.5、50.7、52.9、54.1、55.4、57.8、58.7、59.9 ℃）下30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊糖凝膠電泳檢測，確定最佳退火溫度。

1.3.6 敏感性試驗(yàn)

將病毒模板進(jìn)行10倍系列稀釋，以ddH2O為模板作為為陰性對照，進(jìn)行單項(xiàng)和多重PCR擴(kuò)增，以其模板最高稀釋倍數(shù)擴(kuò)增呈陽性為其PCR的敏感度。

1.3.7 特異性試驗(yàn)

分別以PPV、JEV、豬瘟病毒（CSFV）和豬偽狂犬病毒（PRV）基因組為模板，以ddH2O為模板作為陰性對照，應(yīng)用復(fù)合PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳，驗(yàn)證其特異性。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對PPV和JEV重復(fù)檢測5次，以驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

1.3.9 臨床樣品檢測

應(yīng)用建立的單項(xiàng)PCR與多重PCR方法，檢測實(shí)驗(yàn)室保存的9份疑似感染PPV和JEV的病料，比較兩者檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 DNA的檢測結(jié)果

提取的PPV的DNA濃度為141.9 ng/μL，D260 nm/D280 nm為1.91，比值在1.8～2.0 之間，表明提取的基因組DNA質(zhì)量非常好。

2.2 RNA的檢測結(jié)果

提取的JEV的RNA濃度為1 325.6 ng/μL，D260 nm/D280 nm為1.94，表明提取的RNA質(zhì)量非常好。

2.3 PPV和JEV的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，PPV和JEV分別擴(kuò)增出152、238 bp的片段。PPV單項(xiàng)PCR的最佳退火是57.8 ℃，JEV單項(xiàng)PCR的最佳退火溫度是58.7 ℃，見圖1和圖2。

2.4 復(fù)合PCR擴(kuò)增結(jié)果

電泳結(jié)果（圖3）顯示，PPV和JEV的最佳退火溫度是54.1 ℃。

2.5 敏感性試驗(yàn)

電泳結(jié)果（圖4）顯示，可檢測到PPV和JEV的稀釋濃度分別為10-7、10-5。

2.6 特異性試驗(yàn)

由圖5可知，電泳結(jié)果顯示，PPV和JEV可擴(kuò)增出目的條帶，而CSFV和PRV則沒有產(chǎn)生，說明該方法特異性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以建立的多重PCR方法對PPV和JEV重復(fù)檢測5次。由圖6可知，5次的檢測結(jié)果一致，說明該方法穩(wěn)定性較好。

2.8 臨床樣品檢測

利用建立的復(fù)合PCR方法對9份臨床樣品進(jìn)行檢測，然后使用同樣的特異性引物進(jìn)行單項(xiàng)PCR檢測，結(jié)果顯示兩者結(jié)果符合率100%（表4）。

3 討論與分析

目前，國內(nèi)外發(fā)生的動物病毒病或一個征候群的疫病多同時涉及DNA和RNA兩類病毒[10]。本研究從感染PPV和JEV[CM（24*8]的病死豬組織中提取了DNA和RNA，且在紫外線波長260 nm和280 nm處的比值均在1.8和2.0之間，符合純的DNA D260 nm/D280 nm的值為2.0、純的RNA D260 nm/D280 nm的值為1.8的要求[11]。

在多重PCR反應(yīng)過程中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它關(guān)系到多重PCR反應(yīng)的成功與否。本試驗(yàn)針對PPV和JEV這2種常見病毒的保守基因分別設(shè)計(jì)2對特異性引物，應(yīng)用DNAstar軟件進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示，2對特異性引物較好且同源性較低，各擴(kuò)增片段相差不大，可在同一種濃度的電泳膠下進(jìn)行。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的2對引物經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，均是擴(kuò)增效果較好的引物。

本研究在大量前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首先確定了PPV和JEV單項(xiàng)PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)程序，在此基礎(chǔ)上摸索出了多重PCR的最佳反應(yīng)條件，彌補(bǔ)了多重PCR因引物之間交叉干擾而導(dǎo)致敏感性降低的缺點(diǎn)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該雙重PCR具有較強(qiáng)的敏感性。本研究建立的PPV和JEV雙重PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了這2種病毒的同步檢測，為JEV和PPV感染的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

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