基于表型和ISSR標記的小株型荷花遺傳多樣性分析

徐君　李欣　江君　王歡　姜紅衛

摘要：采用表型性狀和簡單重復序列間擴增（ISSR）標記，對36個碗蓮品種（系）進行遺傳多樣性分析。基于23個表型性狀，品系間歐氏遺傳距離系數平均值為7.78，范圍在3.54～15.78間，聚類分析顯示，以歐氏距離系數E=11.0，可將所有材料分為4組，其中32個聚在一個類群。基于10個ISSR引物，36個品系共獲得62條擴增帶，其中44條具有多態性，多態帶百分率為 71.0%，品系間的遺傳相似性系數平均值為0.40，范圍在0.10～0.71間，以遺傳相似系數GS=0.60，可將所有材料分為3組。ISSR標記分析與表型性狀分析都說明，碗蓮資源遺傳背景狹窄，互相間親緣關系比較接近。

關鍵詞：碗蓮;表型;ISSR;遺傳多樣性

中圖分類號：S682.320.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0137-05

收稿日期：2018-05-24

基金項目：江蘇省林業科技創新與推廣項目（編號：LYKJ[2017]09）;江蘇省蘇州市科技計劃（編號：SNG201508）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，副研究員，主要從事水生花卉分子生物學研究。E-mail：flyforever007@hotmail.com。

通信作者：姜紅衛，碩士，副研究員，主要從事觀賞植物育種與栽培研究。E-mail：sanjwh@163.com。

荷花（Nelumbo nucifera）是我國十大傳統名花之一，深受人們喜愛。小株型荷花品種一般指碗蓮，指在口徑為26 cm以內盆器中可正常生長、開花的一類微型荷花，是人們為了滿足在庭院、廳堂、臥室賞荷的需要而逐步培育出來的[1]。碗蓮以亞洲蓮為主，其變異主要局限于有限的幾個表型性狀，雖然品系較多，但遺傳背景并不豐富，且許多觀賞性狀差異并不一定是遺傳物質本身存在差異，可能是基因表達差異形成的。因此，系統地研究碗蓮品系間的遺傳多樣性，能夠有效減少下一步育種工作中親本選配的盲目性，提高目標性和預見性。此外，碗蓮是荷花的高級進化種，其變異性、遺傳多樣性研究在荷花進化、品種分類等方面也有重要的意義[2]。

隨著分子標記技術的日益發展，其已經成為研究物種遺傳多樣性的重要手段。隨機擴增多態性DNA（RAPD）、簡單重復序列間擴增（ISSR）、擴增片段長度多態性（AFLP）等技術都已被應用于蓮遺傳多樣性研究[3-5]。Li等利用RAPD和ISSR標記對70份中國蓮、7份泰國蓮和2份美洲黃蓮種質進行了遺傳變異檢測，發現多態位點分別達到了91.20%（ISSR）和 96.40%（RAPD）[6]。而Fu等利用AFLP標記對蓮的138份主要栽培品種進行了遺傳多樣性分析，發現多態位點百分率僅為28.7%[7]。試驗材料的差異、分子標記技術的不同，導致蓮品種資源遺傳多樣性分析結果會產生比較大的差異。針對碗蓮的遺傳基礎研究中，孔德政等采用RAPD標記對8個碗蓮品種進行了遺傳分析，并為8個品種分別建立了指紋圖譜[2];管志濤等對23個碗蓮品種的形態學性狀進行分析，發現最長距離法是一種非常有效的碗蓮品種分類的聚類方法[8]。目前碗蓮品種多樣性研究與應用仍處于探索階段。本研究以表型性狀為基礎，在前期構建荷花ISSR分子標記反應體系的基礎上[9]，系統地進行表型性狀、ISSR標記的遺傳多樣性研究，旨在深入揭示碗蓮各品系間遺傳多樣性差異，為進一步充分發掘現有資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的碗蓮資源材料36份，取自蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農業科學院荷花資源保存圃。編號、品種名稱、種源等信息見表1。

1.2 表型性狀調查

表型性狀調查所用36個供試品種（系）于2016年3月統一種植于蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農業科學院荷花資源保存圃。采用標準資源保存池，每個品種種植1池，每池4支種藕，田間管理按常規方法統一進行。性狀調查于7月下旬至10月上旬進行，每個性狀調查（測量）4個樣品（數據），調查方法參照《荷花新品種記載項目》記載標準[10]，共記錄數量性狀9個（最長葉徑、最短葉徑、立葉高、花柄高、花瓣數、最長花徑、花瓣縱徑、花瓣橫徑、心皮），質量性狀14個（株型、初花期、群體花期、著花密度、花香、花蕾型、花型、花態、花瓣尖色、花中色、花基色、雄蕊瓣化、雌蕊成熟形態、青熟花托），質量性狀變異及編碼見表2。

1.3 基因組DNA的提取與ISSR-PCR反應

荷花基因組DNA的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法。PCR反應體系及程序參照荷花ISSR-PCR優化體系[8]，ISSR引物的篩選以哥倫比亞大學于2006年公布的100個引物序列為基礎，選擇條帶多態性、穩定性較好的10個引物。

PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外光下用UV凝膠成像系統觀察結果。

1.4 數據處理與分析

所有表型性狀數據采用DPS 7.05軟件處理，質量性狀通過群落多樣性指數命令計算分布頻率及多樣性指數（H′），數量性狀通過基本參數估計命令統計最小值、最大值、變異幅度、平均值、標準差、變異系數。ISSR-PCR數據統計時選擇凝膠電泳結果中的清晰的譜帶，擴增產物在相同遷移位置有帶賦值1，無帶賦值0，建立原始數據矩陣，統計各引物總擴增帶（amplified bands，簡稱AB）、多態帶（polymorphic bands，簡稱PB）、多態帶百分率（percentage of polymorphic bands，簡稱PPB）。聚類分析利用統計分析軟件DPS 7.05進行數據處理。表型數據分析采用數據標準化、歐式距離系數（E）法計算，聚類方法則采用最長距離法。ISSR標記數據，采用Jaccard遺傳相似系數，聚類方法同樣按最長距離法。記錄36個碗蓮品種（系）相互之間的歐氏遺傳距離及Jaccard遺傳相似系數（GS）（各630個值），統計其在不同數值范圍內出現的頻次。

2 結果與分析

2.1 碗蓮基于表型性狀的遺傳多樣性分析

2.1.1 質量性狀的變異及遺傳多樣性

14個質量性狀的統計分析（表3）表明，參試36個碗蓮品種（系）中，未有花態為碟狀及球狀的資源，未有花瓣尖部及中部為黃綠色、花基部色為紅色的資源，其余各性狀在其描述級別上基本都有分布，但極不均勻。碗蓮為小型荷花，株型絕大多數為中、小型，以中型為多;群體花（周）期有長、短2種表型，參試品種中僅玉繡球為短花期，其余表型均為長花期;著花密度有3種表型，以密度為密所占比例較高;花香有3種表型，以香度適中所占比例較高;花態有3種表型，以碗狀所占比例較高;花瓣尖色、花中色各有4種表型，以紅色所占比例較高;雌蕊成熟形態有3種表型，以結實所占比例較高;青熟花托有3種表型，以斗形所占比例較高。以上9個質量性狀中占比高的表型分布頻率均高于60%，表現出較高的集中性，其多樣性指數相對較低。初花期、花蕾型、花型、花基色、雄蕊瓣化程度5個性狀頻率分布較平均，其多樣性指數較高。

2.1.2 數量性狀的變異及遺傳多樣性

數量性狀的統計分析（表4）表明，36個碗蓮品種（系）數值型性狀差異較大，9個數值性狀的變異系數在15.6%～77.7%間，平均為336%。少瓣型和重臺型荷花花瓣數差異較大， 因此性狀花瓣數變異系數達到77.7%。立葉高、花柄高的變異系數超過了40%，最大葉莖、最小葉莖、花莖、花瓣縱莖、花瓣橫莖等性狀的變異系數也都在20%左右。本研究所記錄的數量性狀多數是與株型大小有關的數據，結果顯示，碗蓮種質資源數值型性狀的變化幅度和變異系數均較大，不同品系株型之間有明顯差異。

2.1.3 表型性狀的遺傳距離及聚類分析

由圖1、圖2可知，基于23個表型性狀，36個碗蓮品種（系）間歐氏距離系數平均值為7.78，變幅為3.54～15.78。所有材料中，以唐婉和紅日間的歐氏距離系數最小，為3.54，2個材料均由中國荷花研究中心育成，株型、花型、花態等性狀均一致，區別僅在于紅日為紅蓮型，唐婉則為花瓣尖紅的粉蓮型;小碧玉和白萬萬間的歐氏距離系數最大，為15.78，小碧玉為所有材料中株型最小的，白萬萬則為所有材料中株型最大的。以距離1.6為標準，統計36個碗蓮品種（系）630個兩兩間距離系數在10個范圍內的出現頻度，DPS 7.05基本參數正態性檢驗發現，系數頻度呈正態分布，頻度峰值出現在系數6.4～8.0之間，共有220個。36個品種（系）間按最長距離法聚類，以系數E=11.00，可將所有材料分為4組，第1類群包含36個材料中的32個，小碧玉、新水蜜桃、白萬萬、玉繡球分類較遠。第1類群以系數E=9.45，可再分為3類，各組間花瓣平均數差距較大，為重要的分類性狀。

2.2 碗蓮基于ISSR分子標記的遺傳多樣性分析

2.2.1 ISSR標記多態性

由表5可知，用所篩選的10個ISSR引物，對36個荷花品種（系）進行擴增，共產生62條大小在150～1 600 bp間的條帶，其中44條具有多態性，多態百分率為71.0%。引物UBC895擴增出的清晰條帶最多，為11條;引物UBC846的擴增條帶數最少，僅有2條。所有引物擴增產物的多態性比率均高于40%，引物UBC840、UBC848擴增條帶的多態性比率最高，為100%。總體上，10個ISSR標記在碗蓮基因組中能揭示較多的信息量。

2.2.2 ISSR標記的遺傳相似系數及聚類分析

由圖1、圖2可知，以36個碗蓮品種和62個位點的譜帶數據為原始矩陣，共獲得630個兩兩不同品種間的遺傳相似系數，系數平均值為0.40，變幅為0.10～0.71，所有材料中，以千堆錦和一捧雪之間的遺傳距離系數最小，為0.10，白佛手與玉繡球間的遺傳距離系數最大，為0.71。以系數0.1為標準，統計36個碗蓮品種（系）630個兩兩間距離系數在10個范圍內出現的頻度，DPS 7.05基本參數正態性檢驗發現，系數頻度呈偏態分布，說明大部分資源遺傳距離比較接近，峰值出現在系數為0.3～0.4之間，共有219個。以0.60為閾值可以把36個碗蓮品種分為3組。

3 討論與結論

表型標記和分子標記是最常用的遺傳多樣性分析方法，分子標記體現的是材料間DNA水平的變異，具有取樣較少、試驗簡單、不受環境影響等優點，但試驗表明，不同的標記、不同的反應引物甚至不同的反應條件都會引起結果的誤差[12]。表型分析記錄的數據較為直觀，是種質資源研究中的基礎，但由于表型是基因與環境互作表達的結果，性狀的表達易受環境影響。徐福榮等通過對表型性狀和SSR標記的比較，認為SSR標記在鑒定云南省水稻主要品系的工作中更為可靠[13]，而石勝友等通過表型性狀與AFLP標記的比較，認為積累相關表型性指標是分子生物學技術在芒果遺傳育種工作中進一步應用的基礎[14]。2種分析方法各有優缺點，在資源遺傳多樣性研究工作中，可結合使用，以達到更好的效果。

本研究利用表型性狀和ISSR標記研究了36份碗蓮資源的遺傳多樣性。所采集的23個表型性狀，主要是基于《荷花新品種記載項目》記錄的碗蓮花、葉、株型等性狀，其中有19個性狀與花有關，涵蓋了花色、花型、高度、大小、生理期等各方面，較為全面地反映了碗蓮花的特征，這些性狀在實際工作中便于觀察和獲取，且均屬于穩定性狀，是新品種登記項目中利用的主要數據，因此這些數據能夠較好地展現觀賞碗蓮花性狀的遺傳多樣性。分析結果顯示，雖然碗蓮資源各性狀在描述級別上大部分都有分布，但分布極不均勻，尤其是作為觀賞花卉比較重要的花色、花態等幾個指標，如參試的碗蓮資源中69.4%為紅花蓮品種，黃蓮品種僅有金玉滿堂1個，而花態為碗狀的資源占總體的80.5%，沒有花態為碟狀和球狀的資源。除玉繡球、小碧玉、新水蜜桃、白萬萬等個別品系，各資源間歐式遺傳距離較為接近。碗蓮資源ISSR標記顯示，雖然多態帶的比例達到71.0%，但除新水蜜桃、白萬萬、金陵女神等個別品系，各資源間遺傳相似系數較為接近，品系間遺傳相似系數主要分布在0.3～0.4間。表型數據分析顯示，各資源間歐氏遺傳距離頻數呈正態分布，而根據ISSR標記數據分析可知，各資源間遺傳相似系數呈偏態分布，說明ISSR標記分析碗蓮資源相互間遺傳距離結果比表型標記分析所得結果要更接近。表型鑒定和ISSR標記結果都說明，碗蓮品種遺傳背景較為狹窄，互相間親緣關系比較接近，分析原因，可能是由于大部分品系是從幾個主要材料雜交選育而來的。

碗蓮是荷花的高級進化種，近年來，隨著育種工作者的辛勤工作，包括碗蓮在內的荷花新品種不斷涌現[15]。但從遺傳多樣性角度而言，碗蓮的遺傳背景仍相對狹窄，可根據多樣性鑒定結果，有針對地引進黃蓮資源、花態為碟狀及球狀、相對株型較大的資源，通過進一步的雜交選育，豐富碗蓮資源的遺傳多樣性。

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