外源茉莉酸甲酯對牛樟芝產總三萜及多糖含量的影響

張知曉　季梅　劉凌　戶連榮

摘要：為了探討茉莉酸甲酯（MeJA）對牛樟芝（Antrodia camphorata）發酵產三萜及多糖的影響及Ca2+對MeJA的誘導作用，向牛樟芝發酵基礎培養基中加入MeJA溶液，設置不同添加濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）、不同時間（0、2、4、6、8 d）、不同溶劑3組試驗，培養后檢測牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內多糖的含量，并同樣測試添加CaCl2的效果。結果表明，用MeJA處理牛樟芝，對其發酵產總三萜、多糖具有積極的促進作用，并且于培養4 d時向發酵培養基中添加用吐溫-80溶解的50 μmol/L MeJA溶液，促進作用最佳。此外，在添加MeJA的同時添加CaCl2的處理較僅添加MeJA的處理的牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內多糖含量顯著增加。

關鍵詞：牛樟芝;MeJA;Ca2+;總三萜;多糖

中圖分類號： S646.9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0133-04

收稿日期：2019-01-03

基金項目：云南省科技計劃項目青年項目（編號：2016FD096）。

作者簡介：張知曉（1988—），女，云南個舊人，碩士，助理研究員，研究方向為森林微生物資源的開發與利用。E-mail：36062613@qq.com。

通信作者：戶連榮，碩士，助理研究員，研究方向為森林生態保護與研究。E-mail：444387051@qq.com。

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟生薄孔菌等，是分屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）的珍稀藥用真菌[1]，被譽為“森林中的紅寶石”[2]。牛樟芝中的三萜類物質是其最主要的1種藥用化學成分，可以起到保肝護肝、抑制癌細胞生長、降血壓、抗炎癥的作用，且牛樟芝中三萜類化合物的含量和種類都是靈芝的數倍，樟芝三萜也因此成為開發樟芝的研究重點之一[3]。此外，樟芝中含有的多糖對人體起到提高免疫力、抑制病毒的作用，對保護肝臟也有一定的效果[4]。

茉莉酸甲酯（MeJA）是一種脂肪酸衍生物，在植物中起著信號傳遞的作用，同時能夠明顯促進植物產生次級代謝產物[5]。已有研究表明，將MeJA作為誘導劑添加到靈芝（Ganoderma lucidum）和樺褐孔菌（Inonotus obliquus）的發酵培養基中，發酵后的三萜產量均較對照有明顯提高[6-7]。而在這方面，關于同屬多孔菌目牛樟芝的研究還未見報道。此外，鈣（Ca）是生物生長必需的營養元素，參與構成生物組織，調節生物生長發育，參與調控植物抗逆等生理反應[8]。已有部分研究發現，Ca2+參與MeJA介導的信號轉導過程，如馬泓思等發現，外源Ca2+離子能進一步增強MeJA 誘導的白樺（Betula platyphylla）細胞懸浮液合成三萜類物質的效果[9]。而關于Ca2+促進MeJA誘導真菌合成三萜類物質方面的研究尚未見報道。基于牛樟芝中的三萜、多糖具有極高的藥用價值，本研究以牛樟芝為試驗材料，研究MeJA對牛樟芝2種藥用成分的影響及Ca2+處理對MeJA作用的影響，以期初步探明1種增加牛樟芝三萜及多糖產量的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用菌種為從中國臺灣引進的牛樟芝優良菌株。

1.1.1 培養基和菌株培養條件 基礎培養基配方：25 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g麥芽糖，3 g酵母提取物，1 g KH2PO4，1 g MgSO4，1 g維生素B1，1 L水，pH值5.5。

孢子懸浮液的制備方法：取已培養20d的牛樟芝培養皿，用20 mL無菌水洗下培養皿表面的孢子備用。

基礎培養方法：在500 mL三角瓶中裝100 mL基礎培養基，接入1 mL牛樟芝孢子懸浮液，搖床上于100 r/min、26 ℃恒溫培養12 d后，收集菌絲。

1.1.2 主要試劑 茉莉酸甲酯，購于Sigma公司;齊墩果酸及其他試劑，購于昆明騰科科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗時間和地點 本試驗于2018年3—7月在云南省林業科學院實驗室內進行。

1.2.2 樣品處理 （1）將MeJA用無水乙醇配制成終濃度為25、50、75、100、200 μmol/L的溶液。采用0.2 μm的無菌針頭式過濾器過濾進行滅菌處理后，在基礎搖瓶發酵方法的基礎上，于4 d后添加到培養基中，添加量為2 μL/mL，搖床培養，每個處理設3個重復。培養結束后取樣分析其生物量、總三萜量、胞內多糖和胞外多糖量。

（2）將MeJA用無水乙醇配制成終濃度為50 μmol/L的溶液。于不同培養時間（培養0、2、4、6、8d）添加到培養基中，搖床培養，每個處理設3個重復。培養結束后取樣分析。

（3）以無水乙醇、吐溫-20、吐溫-80作為助溶劑，將MeJA配制成終濃度為50 μmol/L的溶液，于4 d后添加到培養基中，搖床培養，每個處理設3個重復。培養結束后取樣分析，篩選出MeJA的最佳添加方案。

在MeJA最佳添加方案的基礎上，向培養基中同時添加CaCl2，使CaCl2的終濃度為75 nmol/L。另外設置2組對照組，分別僅向培養基中添加MeJA、CaCl2。設3組獨立試驗。培養結束后取樣分析其生物量、總三萜量、胞內多糖和胞外多糖量。

1.2.3 生物量的測定 生物量的測定方法參照文獻[10]。通過抽濾分離發酵液與菌絲體，菌絲體用蒸餾水反復沖洗至洗液變為無色，置于干燥箱中，于70 ℃烘干至恒質量，對干燥菌絲體用精度為0.001 g的電子天平稱量，即得菌絲體生物量。

1.2.4 菌絲體內總三萜含量的測定 采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色體系對總三萜含量進行測定。具體步驟參考楊彬君等的方法[11]。

1.2.5 胞外多糖含量的測定 胞外多糖含量的測定方法參照文獻[12]。將發酵液（用濾紙）過濾，取100 mL濾液在 60 ℃ 下旋轉蒸發，使濾液濃縮至原體積的1/3，加3倍體積的無水乙醇靜置沉淀24 h，4 000 r/min離心分離15 min，沉淀經無水乙醇輕輕沖洗后，用烘箱于50 ℃烘干至恒質量，得到胞外粗多糖。

1.2.6 胞內多糖含量的測定 胞內多糖含量的測定方法參照文獻[13]。將菌絲體用烘箱烘干至恒質量，研磨過篩，置于圓底燒瓶中，加30倍體積的水，于80 ℃水浴1 h，水浴提取后，再用超聲波提取30 min，重復2次提取多糖，合并提取液，離心、過濾，濾液用硫酸-苯酚法測定多糖含量。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計和數理分析。

2 結果與分析

2.1 MeJA不同添加濃度對牛樟芝發酵特性的影響

MeJA不同添加濃度對牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖1-a所示，可見當MeJA添加濃度為25 μmol/L時，1L發酵液中的牛樟芝生物量達9.46 g;當MeJA添加濃度為50 μmol/L 時，牛樟芝的生物量達9.25 g/L，與MeJA添加濃度為25 μmol/L處理間的生物量無顯著差異;當MeJA添加濃度為0 μmol/L時，牛樟芝的生物量較MeJA添加濃度為 25 μmol/L 時降低了2.55 g/L，但顯著高于MeJA添加濃度為100、200 μmol/L時的生物量。三萜含量在MeJA添加濃度為50 μmol/L時最高（14.21 mg/g），其次為MeJA添加濃度為25、100 μmol/L的處理，當MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時，三萜含量最低。

MeJA不同添加濃度對牛樟芝胞外多糖及胞內多糖含量的影響如圖1-b所示，可見當MeJA添加濃度為50 μmol/L時，牛樟芝胞外多糖、胞內多糖含量均最高，分別為 10.27 g/L、11.5mg/g;當MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時，胞外多糖含量均較低，二者間無顯著差異，而當胞內多糖含量最低時，對應的MeJA添加濃度為200 μmol/L。

2.2 MeJA不同添加時間對牛樟芝發酵特性的影響

MeJA不同添加時間對牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖2-a所示，可以看出，于培養4 d時添加MeJA發酵的牛樟芝生物量顯著高于其他時間的生物量，為12.04 g/L，而于培養8 d時添加MeJA產生的生物量最低，僅為7.11 g/L。于培養0、2、4 d時添加MeJA的三萜含量分別為15.48、15.12、16.42 mg/g，三者間無顯著差異，但顯著高于其他試驗組。

MeJA不同添加時間對牛樟芝胞外多糖及胞內多糖含量的影響如圖2-b所示，可以看出，于培養4 d時添加MeJA發酵的胞外多糖含量最高，達15.18 g/L，于培養6、8 d時添加MeJA產生的胞外多糖含量較低，分別較培養4 d時降低了53%、60%。同樣，于培養4 d時添加MeJA產生的胞內多糖含量最高（12.2 mg/g），其次是培養2 d時添加MeJA的胞內多糖含量，二者間無顯著差異， 于培養8 d時添加MeJA產生的胞內多糖含量最低，僅為6.4 mg/g。

2.3 MeJA不同溶劑對牛樟芝發酵特性的影響

由表1可以看出，以吐溫-80為溶劑的MeJA溶液對牛樟芝發酵后生物量的促進作用最佳，生物量達到8.25 g/L，單獨添加吐溫-80溶液的效果次之;以無水乙醇為溶劑的MeJA溶液處理的生物量為6.16 g/L，單獨添加無水乙醇溶液的生物量為3.48 g/L;以吐溫-20為溶劑的MeJA溶液和單獨添加吐溫-20的溶液發酵的牛樟芝生物量均為0 g/L。幾組處理的三萜含量排序如下：添加MeJA（無水乙醇）溶液≥添加MeJA（吐溫-80）溶液>吐溫-80≥無水乙醇。

比較胞內多糖、胞外多糖含量可知，兩者均在以吐溫-20為溶劑的試驗組最低，次低的是以無水乙醇為溶劑的試驗組，而在以MeJA（吐溫-80）溶液為溶劑的試驗組最高，較無水乙醇試驗組分別提高了71%、34%。

2.4 Ca2+介導MeJA的影響（添加Ca2+對MeJA誘導作用的影響）

如圖3所示，發酵后牛樟芝生物量、胞外多糖含量和胞內多糖含量均呈現出相同的趨勢，表現為MeJA+CaCl2>MeJA>CaCl2>CK，而發酵后的三萜含量為MeJA+CaCl2>MeJA>CK>CaCl2。其中，效果最好的MeJA+CaCl2組牛樟芝的生物量、三萜含量、胞外多糖含量和胞內多糖含量分別為 10.91 g/L、13.48 mg/g、6.36 g/L、8.80 mg/g，分別較CK提高了79.10%、27.90%、77.20%、103.02%。

3 結論與討論

茉莉酸甲酯對多種次生代謝產物的合成具有誘導作用[14]，近些年來也陸續出現將其用于微生物發酵上的研究。辛燕花等將MeJA添加于靈芝發酵培養基中，發現它能夠提高靈芝多糖、靈芝酸的產量[15]。楊文建等發明了1種用MeJA溶液噴灑雙孢蘑菇的方法，經證實該方法能夠促進雙孢蘑菇產麥角甾醇[16]。此外，MeJA還能夠促進微生物細胞中萜類物質的合成，Ren等首次將MeJA作為誘導劑添加到靈芝發酵培養基中，發現其靈芝三萜的產量比未經處理的提高了45.3%[6]。向超也證實，用MeJA誘導樺褐孔菌發酵產三萜，其三萜總產量較對照提高了53.2%[7]。本研究結果表明，在液體發酵過程中添加MeJA，能顯著提高牛樟芝發酵的生物量與三萜、胞外多糖、胞內多糖含量，最適宜的添加濃度為50 μmol/L，于培養4d時對各指標的促進效果最佳，以吐溫-80作為溶劑最有利于MeJA發揮促進作用。而有研究發現，吐溫-20對牛樟芝的生長具有強烈的抑制作用，這可能由于其具有較短的碳鏈，作為表面活性劑在細胞壁內表現出較高的擴散率，可能會造成細胞膜受損，或者影響與其他細胞內生物分子的相互作用，甚至會降低細胞的存活率[17]。

目前，MeJA誘導微生物產三萜的機制已經明確，這些萜類化合物都是由單個異戊二烯通過甲羥戊酸途徑合成得到的，MeJA能夠促使甲羥戊酸途徑中hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、lss和ss等相關酶基因的超表達[18-21]。以茯苓為研究對象，探究MeJA誘導其產三萜的效果及機制發現，于發酵第4天添加MeJA溶液（150 μmol/L），可使得到的三萜含量較空白組增加0.55倍;實時熒光定量PCR分析可知，其sqs（甲基戊酸途徑鯊烯合酶基因）和fps（法尼基焦磷酸合成酶基因）的表達水平均發生了顯著上調[22]。任昂也以靈芝為材料，探究了在三萜的生物合成途徑中，關鍵酶編碼基因轉錄受MeJA的影響，結果表明，hmgr、fps、sqs、osc等基因均被誘導表達[23]。

鈣有多種生物學功能，是非常重要的第二信使，通過改變細胞質中游離的Ca2+濃度，可以將細胞表面上接收的信號傳遞到細胞內，并由一系列效應器接收和分析，調節生物生長、發育等生理反應[24]，在微生物中，Ca2+經常作為活性酶的輔因子或激活因子發揮作用[25]。在本研究中，同時添加MeJA、CaCl2時，牛樟芝發酵后的生物量、三萜含量、胞外多糖和胞內多糖含量較單獨添加MeJA及其他試驗組明顯提高。結果表明，Ca2+對MeJA誘導牛樟芝發酵產三萜等有用物質起到了積極的介導作用，這與王艷用Ca2+介導MeJA誘導白樺懸浮培養產三萜的試驗結果相似[26]。

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