甲基磺酸乙酯誘變篩選強耐鹽旱柳愈傷組織變異體研究

王瑩　郭聰　談峰　李玉娟

摘要：為獲得強耐鹽旱柳愈傷組織突變體，采用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理旱柳愈傷組織，對得到的旱柳愈傷組織變異體進行耐鹽性檢驗。結果表明，0.4% EMS處理3 h為旱柳愈傷組織的半致死處理方式;愈傷組織存活率和生長率會隨鹽濃度的升高而降低，NaCl為0.4%時，愈傷組織的死亡率為93.6%;對篩選出的愈傷組織突變體進行鹽脅迫形態(tài)與生理指標檢驗，誘變組SOD活性、POD活性、積累可溶性蛋白的能力比對照組高，而MDA含量始終低于對照組。旱柳愈傷組織突變體在0.4% NaCl脅迫下可正常生長，而原親本只能耐受0.2%鹽濃度，誘變體比原親本耐鹽性提高了100%。

關鍵詞：甲基磺酸乙酯（EMS）;旱柳;強耐鹽性;愈傷組織;變異體

中圖分類號： S792.120.5;Q813.1+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0057-04

收稿日期：2018-06-28

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（16）1005、CX（17）1004]。

作者簡介：王 瑩（1986—），女，江蘇南通人，碩士，助理研究員，主要從事耐鹽苗木新品種培育及配套栽培技術方面的研究。E-mail：466625450@qq.com。

通信作者：李玉娟，副研究員，主要從事園林植物的育種、繁殖與栽培研究。E-mail：lyglyj90@sohu.com。

旱柳（Salix matsudana Koidz）為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）落葉喬木、灌木或亞灌木，在世界上分布廣泛[1]，具有速生、成材早等優(yōu)點，且具有一定的抗旱、耐鹽、耐瘠薄、抗風沙能力，是平原地區(qū)重要的造林綠化植物，也是固堤護岸、防風固沙、凈化大氣和改良鹽堿地的重要樹種[2]。隨著沿海開發(fā)被提升為國家戰(zhàn)略之際，更多的科研工作者將沿海灘涂的綜合開發(fā)與柳樹耐鹽性的遺傳改良工程相結合進行研究。張繼明等利用傳統(tǒng)的雜交育種方式，進行多年試驗，選育出3個速生且抗鹽的優(yōu)良柳樹新品種[3];余春梅等利用分子生物學手段，在擬南芥中過量表達柳樹耐鹽性相關SVP1.1s基因，為選育優(yōu)良耐鹽林木提供重要材料[4]。但到目前為止，由于傳統(tǒng)方法的育種限制，其耐鹽等級大都僅局限于輕度或中度耐鹽水平[5]，強耐鹽柳或特耐鹽柳成功選育或已產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報道鮮有報道，故柳樹資源的開發(fā)利用受到了極大的制約。

誘變育種是一個非常規(guī)、有效的育種方式，其借用生物、化學或物理手段，在洋亞麻（Linumu sitatissimum L.）[6]、番茄（Lycopersicones culentum Mill.）[7]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[8]等植物耐鹽新品系的培育中顯示出極其重要的作用和誘人的前景。其中甲基磺酸乙酯（EMS）是一個高效、穩(wěn)定的化學誘變劑，目前在植物誘變育種中應用最廣泛、效果最好，誘變后產(chǎn)生的突變頻率高，且多為顯性突變體，易于進行耐鹽突變體的篩選和育種[9]。近年來，育種工作者們通過EMS誘導耐鹽突變體途徑，已成功獲得了耐鹽番茄[7]、耐鹽纖維亞麻[10]、耐鹽菊花[Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.][11]等多種不同耐鹽等級的突變體植物新品種，大大豐富了耐鹽植物的種質(zhì)資源，對功能基因組學研究亦具有非常重要的作用。因此本研究在前期選育的強耐鹽柳樹新品系的基礎上，通過EMS人工化學誘導形成柳樹強耐鹽突變體方式，進一步在細胞水平上進行NaCl定向篩選，以期為旱柳強耐鹽品種的選育提供基礎材料，為耐鹽堿植物的選育提供一種高效的育種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年3月在江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所組培實驗室進行。在本項目組前期建立的旱柳愈傷組織繁育體系基礎上，選取長勢一致的健壯旱柳愈傷組織作為供試材料，進行EMS誘變處理及鹽脅迫試驗。

1.2 方法

1.2.1 EMS誘變處理及半致死量的確定 將旱柳愈傷組織放入無菌三角瓶中，加入不同濃度的EMS（0、0.2%、0.4%、0.6%）分別浸泡1、2、3、4 h，無菌水沖洗干凈后接種于培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計成活率，最終確定旱柳的EMS最佳半致死劑量。

1.2.2 強耐鹽愈傷組織突變體的篩選 采用多步正篩選法，分別配制含愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基，選取生長健壯的旱柳愈傷塊，分別接種于不同NaCl（0、0.4%、0.6%、0.8%）培養(yǎng)基中，每7、14、21 d進行取樣，統(tǒng)計愈傷組織成活率和生長率，確定NaCl的95%致死劑量。

1.2.3 強耐鹽愈傷組織突變體耐鹽性及穩(wěn)定性分析

1.2.3.1 臨界濃度NaCl脅迫下繼代次數(shù)對愈傷組織存活率的影響 將篩選獲得的旱柳強耐鹽愈傷組織回接到無壓力的基本培養(yǎng)基中，然后選擇生長旺盛的愈傷組織再返回接到含NaCl（臨界濃度）的篩選培養(yǎng)基中，每2周繼代1次，共繼代6次，通過測定愈傷組織存活率，確定其耐鹽穩(wěn)定性。

1.2.3.2 臨界濃度NaCl脅迫對突變體愈傷組織各種耐鹽性指標的影響 將獲得的強耐鹽旱柳愈傷組織突變體轉(zhuǎn)入不含鹽的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)3代后，再轉(zhuǎn)入含不同濃度NaCl（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對照也培養(yǎng)相同時間，每30 d取樣，測定過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等相關耐鹽生理生化指標，并與原親本相關指標進行對比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)整理、計算及作圖。

2 結果與分析

2.1 EMS誘變處理及半致死量的確定

從表1可以看出，旱柳愈傷組織成活率隨處理時間的延長或EMS濃度升高而降低。在不加EMS條件下，愈傷組織的存活率均為100.00%;低濃度EMS處理對愈傷組織的殺傷力較弱，其平均存活率仍在60%以上;而當EMS濃度達到06%及以上時，愈傷組織存活率較低。用0.4% EMS處理 3 h 條件下，其愈傷組織存活率達49.67%。最終根據(jù)50%致死劑量和存活率確定旱柳愈傷組織最佳處理方式為0.4% EMS浸泡3 h。

2.2 強耐鹽愈傷組織突變體的篩選

采用多步正篩法對旱柳強耐鹽愈傷組織突變體進行篩選，如圖1、圖2顯示，旱柳的愈傷組織存活率和生長率均隨鹽濃度的升高而降低。在NaCl的濃度低于0.2%時，鹽濃度對愈傷組織的成活率和分化率影響不大;當NaCl濃度達到0.4%時，旱柳的愈傷組織存活率為6.3%，生長率也表現(xiàn)出相似的趨勢;0.6% NaCl處理時，愈傷組織幾乎不生長或生長受到嚴重抑制;而0.8% NaCl脅迫條件下，愈傷組織全部褐化死亡。根據(jù)NaCl對旱柳愈傷組織的95%致死劑量率和繼續(xù)培養(yǎng)過程中愈傷組織的分化率表現(xiàn)，最終確定滿足試驗要求的NaCl臨界濃度為0.4%。

2.3 臨界濃度NaCl脅迫下繼代次數(shù)對愈傷組織存活率的影響

在臨界濃度NaCl（0.4%）脅迫下繼代6次，結果如圖3顯示，通過誘變處理得到的旱柳愈傷組織在鹽脅迫下能表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的耐受性，且隨著繼代次數(shù)的增加，存活率均能保持在50%以上，尤其在第3代時存活率最高，達到76.7%。

2.4 NaCl脅迫對突變體愈傷組織各種耐鹽性指標的影響

2.4.1 不同NaCl脅迫對旱柳愈傷組織突變體SOD活性的影響 SOD活性的強弱，是植物抗逆性的重要指標之一。由圖4看出，與對照組相比，誘變組的旱柳愈傷組織SOD活性明顯高于對照愈傷組織;0.2%濃度鹽脅迫下，對照組SOD活性最大;誘變組在0.4%濃度NaCl條件下活性最大，培養(yǎng) 30 d 時誘變的愈傷組織SOD活性最高，是對照組的2.46倍;60 d 時對照組SOD活性最低，僅為9.54 U/mg。這說明，在鹽脅迫條件下，誘變組愈傷組織具有較高的SOD活性，來保護膜系統(tǒng)。

2.4.2 不同NaCl脅迫對旱柳愈傷組織突變體POD活性的影響 POD是存在于植物細胞中最重要的清除自由基的酶類之一。由圖5可以看出，當旱柳愈傷組織處于逆境脅迫條件下時，POD活性先升高再下降，且誘變組POD活性均高于對照組;在培養(yǎng)30 d時，0.4% NaCl脅迫時POD活性達到最高值，為100.8 U/（g·min）。變異體愈傷組織在受到鹽脅迫時，比對照POD活性高，說明誘變組愈傷組織比對照組具有更強的耐鹽適應性。

2.4.3 不同NaCl脅迫對旱柳愈傷組織突變體MDA含量的影響 MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一。MDA含量的多少可代表膜損傷程度的大小。由圖6可知，誘變組的MDA含量始終低于對照組。愈傷組織在鹽脅迫條件下，隨著處理時間的延長，對照組MDA含量先增加后下降;0.2%濃度鹽脅迫下，對照組培養(yǎng)30 d時MDA含量達到最大值（0.615 nmol/mL），是相同處理條件下誘變組的1.42倍。誘變愈傷組織的膜損傷程度低于對照，誘變愈傷組織比對照愈傷組織更適應鹽脅迫環(huán)境。

2.4.4 不同NaCl脅迫對旱柳愈傷組織突變體可溶性蛋白含量的影響 由圖7可見，隨著NaCl濃度的升高，對照組可溶性蛋白含量先增加后降低;在NaCl濃度0～0.4%，誘變組可溶性蛋白含量隨NaCl濃度的升高而升高，當NaCl濃度為04%時，培養(yǎng)60 d時誘變組可溶性蛋白含量最高，為對照的 6.19倍，說明耐鹽愈傷組織變異體在鹽脅迫條件下積累可溶性蛋白的能力大大強于對照。

3 結論與討論

EMS誘變技術是應用最為廣泛的農(nóng)作物新品種育種技術之一，育種家們利用EMS誘變已成功創(chuàng)制出了大批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新種質(zhì)資源[12-14]，而在林木誘變育種工作中尚不多見。本研究在明確適于旱柳的最佳EMS誘變條件基礎上開展大規(guī)模EMS誘變處理，首次構建了旱柳愈傷組織EMS突變體庫。在0.4% EMS浸泡處理3 h誘變條件下，獲得了一批旱柳愈傷組織突變體;再經(jīng)NaCl脅迫與逐級篩選，最終獲得了一批耐鹽性優(yōu)良的愈傷組織;通過生長狀態(tài)觀察與生理指標測定，旱柳愈傷組織突變體在0.4% NaCl脅迫下可正常生長，而原親本只能耐受0.2%鹽濃度，誘變體比原親本耐鹽性提高了100%。本研究為耐鹽柳樹種質(zhì)創(chuàng)新以及功能基因組學研究提供了基礎性材料。

EMS誘導涉及復雜的物理、化學過程，雖然突變效果明顯，但不同的材料適宜的處理濃度及誘導時間均有很大的差異，必須正確地掌握EMS誘變劑的最佳劑量、濃度以及處理時間。劉威等研究甲基磺酸乙酯的特性時發(fā)現(xiàn)，20 ℃下EMS半衰期為93.1 h，產(chǎn)物易溶于水且形成無誘變作用但對愈傷組織有一定毒害作用的有機酸，處理時間越長毒害作用越強，選擇最適宜誘變劑濃度和處理時間尤為重要[15]。Bidabadi等在用EMS誘變香蕉莖尖時發(fā)現(xiàn)，不同的香蕉品種對EMS耐受的半致死濃度不同[16]。張大燕等采用多濃度EMS對川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）進行不同時間段的處理，篩選出了最佳的濃度與時間組合[17]。一般隨著EMS濃度的升高，材料致死率也會逐漸升高，本次試驗中也發(fā)現(xiàn)高濃度、長時間處理旱柳愈傷組織，會導致組培材料的存活率和生長率明顯降低，這與前人的EMS處理結果相似。同時研究過程中，在構建的旱柳愈傷組織誘變體庫時，一部分材料在受到臨界濃度鹽脅迫時，突變性狀在后代中未能得到穩(wěn)定遺傳，尤其是第1次繼代，成活率僅為54.2%，這可能與EMS生理損傷、試驗群體大小、突變性狀調(diào)控的復雜性等因素有一定的關系。

在田小霞等的研究中發(fā)現(xiàn)，在受到鹽脅迫時，材料細胞會通過積累大量的可溶性蛋白，增加SOD、POD活性等一系列的生理生化反應來適應逆境[18-19]，本試驗也得到了與之相似的研究結果。EMS是一種常見的烷化劑之一，其分子具有多個能被轉(zhuǎn)移的活性烷基，可轉(zhuǎn)移到電子云密度較高的分子上，置換堿基中的H原子[20]。EMS誘變使旱柳DNA分子上產(chǎn)生較多的點突變，鹽脅迫后變異體與對照組生理生化指標呈現(xiàn)出明顯的差異，同處理條件下，SOD、POD活性和可溶性蛋白含量最多，分別比對照提高了5.1倍、9.2倍和5.2倍，對照組培養(yǎng)30 d時MDA達到最大值，在相同處理條件下是誘變組的1.42倍。綜合各生理指標，說明鹽脅迫對旱柳愈傷組織變異體的損傷較小。

本研究只針對EMS誘變處理的濃度和時間組合對旱柳愈傷組織的生長和耐鹽性生理指標做了研究，初步選擇出耐鹽性良好的旱柳愈傷組織變異體，為日后強耐鹽柳樹突變植株的培育提供材料。但是誘變后如何對再生植株進行鑒定分析，如何篩選具有目的性狀并可以穩(wěn)定遺傳的變異植株，以及深入開展旱柳強耐鹽突變體庫基因突變位點分布和誘變機制，還需要進一步研究。

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