丙泊酚抑制膠質瘤細胞侵襲和轉移的內質網應激機制

阮林 朱卓麗 連肖強 黃煥森

【摘要】 目的 觀察丙泊酚對膠質瘤細胞侵襲和轉移的影響， 探討內質網應激（ERS）在膠質瘤細胞侵襲和轉移的作用機制。方法 人膠質瘤細胞系U87-MG細胞培養分為對照組（C組）、2 μg/ml組、5 μg/ml組和10 μg/ml組， 分別加入濃度為0、2、5和10 μg/ml丙泊酚溶液。采用MTT法檢測細胞活力;Transwell侵襲遷移測定侵襲細胞數;劃痕實驗測定遷移率;Western blot檢測細胞葡萄糖調節蛋白78（GRP78）和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）表達。比較每組細胞細胞活力、侵襲細胞數、遷移率及GRP78和CHOP表達。結果 2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞活力低于C組， 且隨丙泊酚劑量增加膠質瘤細胞活力及遷移率逐漸降低， 差異有統計學意義（P<0.05）。2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞侵襲細胞數少于C組， 2 μg/ml組膠質瘤細胞侵襲細胞數多于5、10 μg/ml組， 差異有統計學意義（P<0.05）。

C組與5、10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。2 μg/ml組與5、10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。5 μg/ml組與10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。C組與2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞CHOP表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。10 μg/ml組與2、5 μg/ml組膠質瘤細胞CHOP表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 丙泊酚可抑制人膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力， 其機制可能與激活內質網應激標志蛋白GRP78和CHOP表達變化有關。

【關鍵詞】 丙泊酚;膠質瘤細胞;內質網應激

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.31.105

Endoplasmic reticulum stress mechanism of propofol inhibiting invasion and metastasis of glioma cells ? RUAN Lin， ZHU Zhuo-li， LIAN Xiao-qiang， et al. Department of Anesthesia， Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

【Abstract】 Objective ? To observe the effect of propofol on invasion and metastasis of glioma cells， and discuss the mechanism of endoplasmic reticulum stress （ERS） in invasion and metastasis of glioma cells. Methods ?Human glioma cell line U87-MG was divided into control group （group C）， 2 μg/ml group， 5 μg/ml group and?10 μg/ml group， and propofol solution was added at concentrations of 0， 2， 5 and 10 μg/ml， respectively. Cell viability was detected by MTT assay， number of invasive cell by Transwell invasion and migration assay， migration rate by scratch assay， and expression of cell glucose regulatory protein 78 （GRP78） and CCAAT / enhancer binding protein homologous protein （CHOP） by Western blot. Cell viability， number of invasive cell， migration rate and expression of GRP78 and CHOP were compared in each group. Results ?The cell viability of glioma cells in 2， 5 and 10 μg/ml group was lower than that in group C， and the cell viability and migration rate of glioma cells decreased with the increase of propofol dosage， the difference was statistically significant （P<0.05）. The number of invasive cell of glioma cells in 2， 5 and 10 μg/ml group was lower than that in group C， and 2 μg/ml group was more than 5 and 10 μg/ml group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. There was statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells in group C and 5 and 10 μg/ml group （P<0.05）. 2 μg/ml?group and 5 and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. 5 μg/ml group and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. Group C and 2， 5 and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of CHOP of glioma cells （P<0.05）. 10 μg/ml group and 2， 5 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. Conclusion ? Propofol inhibits the invasion and migration of human glioma cells， and its mechanism may be related to the activation of endoplasmic reticulum stress marker proteins GRP78 and CHOP.

【Key words】 Propofol; Glioma cells; Endoplasmic reticulum stress

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發腫瘤， 膠質瘤細胞的高度增殖性和侵襲性是其主要的病理特征， 是預后不良的主要原因[1]。丙泊酚化學名為2， 6-二異丙基苯酚， 是一種靜脈麻醉藥物， 常用于全身麻醉的誘導和維持， 特點是起效快， 持續時間短， 蘇醒迅速而平穩， 不良反應少， 廣泛應用于各種外科手術中。研究發現丙泊酚在許多腫瘤， 如肺癌、胃癌和結腸癌等中有抗腫瘤的作用[2]。內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）促腫瘤侵襲是腫瘤調控的新機制[3]。

1 材料與方法

1. 1 細胞培養 人膠質瘤細胞系U87-MG細胞常規培養。在10%胎牛血清含青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 mg/L）的1640培養基中， 37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。

1. 2 實驗分組 人膠質瘤細胞系U87-MG細胞培養分為4組（n=24）：對照組（C組）、2 μg/ml組、5 μg/ml組和10 μg/ml組， 分別加入濃度為0、2、5和10 μg/ml丙泊酚溶液， 孵育6 h后換培養液， 繼續培養18 h。

1. 3 MTT法測定 人膠質瘤細胞系U87-MG細胞密度為5×104/ml， 接種于96孔板中， 每孔200 μl。各組取6孔， 每孔加入含MTT濃度為5 mg/ml的PBS 20 μ1， 培養4 h待甲躦結晶形成后加入二甲基亞砜150 μl， 置于酶標儀570 nm波長下測定吸光度值， 反映細胞活力。

1. 4 Transwell侵襲遷移測定 細胞侵襲與遷移能力測定采用24孔Transwell小室和Matrigel（B&D公司）。細胞培養至80%融合時， 收集細胞， 調整細胞數為5×105/ml;Transwell下室中加入600 μl含丙泊酚處理 RPMI 1640培養液孵育40 h。0.1%結晶紫染色15 min， 每個濾膜隨機在顯微鏡下選取8個高倍視野（×200）， 計數穿過聚碳酯膜的細胞。

1. 5 細胞劃痕實驗 細胞接種6孔板至細胞80%融合， 各組取6孔， 用20 μl無菌槍頭做垂直于孔板長緣的均勻劃痕。以100倍視野攝片并標記攝片位置（T0）， 培養24 h在相同位置再次攝片（T1）。用Image Pro Plus軟件拍攝照片的劃痕距離， 計算細胞遷移率=（T0距離-T1距離）/T0距離×100%。

1. 6 Western blot檢測 細胞加入蛋白裂解液及PMSF， 超聲破碎， 4℃、12000 r/min離心40 min， 取上清。用Bradford法對上清做蛋白定量。取20 μg蛋白作10% SDS-PAGE電泳， 100 V轉移1 h至PVDF膜， 葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein78， GRP78）和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein， CHOP） 4℃過夜。將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗IgG抗體孵育， 用ECL化學發光試劑觀察條帶。用不含抗體TBST液孵育作陰性對照。圖像分析測定各帶作定量分析， 以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值反映蛋白的表達。

1. 7 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞活力低于C組， 且隨丙泊酚劑量增加膠質瘤細胞活力逐漸降低， 差異有統計學意義（P<0.05）。2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞侵襲細胞數少于C組， 2 μg/ml組膠質瘤細胞侵襲細胞數多于5、10 μg/ml組， 差異有統計學意義（P<0.05）。而5和10 μg/ml P組侵襲細胞數比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞遷移率低于C組， 且隨丙泊酚劑量增加膠質瘤細胞遷移率逐漸降低， 差異有統計學意義（P<0.05）。C組與2 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。

C組與5、10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。2 μg/ml組與5、10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。5 μg/ml組與10 μg/ml組膠質瘤細胞GRP78表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。C組與2、5和10 μg/ml組膠質瘤細胞CHOP表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。10 μg/ml組與2、5 μg/ml組膠質瘤細胞CHOP表達比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。2 μg/ml組與5 μg/ml組膠質瘤細胞CHOP表達比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

丙泊酚在體外實驗中抑制HeLa細胞株、HT1080細胞株、黑色素瘤細胞株的侵襲， 在小鼠骨肉瘤模型中丙泊酚可降低小鼠骨肉瘤細胞株LM8的肺轉移[4]。丙泊酚作用于人乳腺癌細胞， 抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）信號途徑， 從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移[5]。小劑量丙泊酚能夠促進食管鱗癌細胞Ecal09的增殖、遷移與侵襲并抑制凋亡[6]。丙泊酚對腫瘤生物學行為影響的研究尚存在爭議。

GRP78是熱休克蛋白70（HSP70）家族成員之一， 在成熟組織中表達量很低， 但ERS時可大量產生， 與腫瘤細胞的侵襲轉移、耐藥等密切相關[7]。CHOP屬于C/EBP家族成員之一， 參與ERS介導細胞凋亡的特有途徑[8]。本實驗采用人膠質瘤細胞進行研究， 以不同劑量濃度丙泊酚處理膠質瘤細胞活力、侵襲細胞數、遷移率下降， GRP78和CHOP表達下調。

綜上所述， 丙泊酚可抑制人膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力有一定抑制作用， 其機制與ERS有關， 為丙泊酚在膠質瘤圍術期應用提供理論基礎。

參考文獻

[1] Carabenciov ID， Buckner JC. Controversies in the therapy of low-grade gliomas. Curr Treat Options Oncol， 2019， 20（4）：25.

[2] Sun H， Gao D. Propofol suppresses growth， migration and invasion of A549 cells by down-regulation of miR-372. BMC Cancer， 2018， 18（1）：1252.

[3] Grootjans J， Krupka N， Hosomi S， et al. Epithelial endoplasmic reticulum stress orchestrates a protective IgA response. Science， 201， 363（6430）：993-998.

[4] Mammoto T， Mukai M， Mammoto A， et al. Intravenous anesthetic， propofol inhibits invasion of cancer cells. Cancer Lett， 2002， 184（2）：165-170.

[5] Li Q， Zhang L， Han Y， et al. Propofol reduces MMPs expression by inhibiting NF-κB activity in human MDA-MB-231 cells. Biomed Pharmacother， 2012， 66（1）：52-56.

[6] 張靈敏， 張明鑫， 王寧， 等. 小劑量丙泊酚對食管鱗癌細胞Ecal09生物學行為的影響. 細胞與分子免疫學雜志， 2011， 27（4）：402-404.

[7] Bailly C， Waring MJ. Pharmacological effectors of GRP78 chaperone in cancers. Biochem Pharmacol， 2019（163）：269-278.

[8] Wang Y， Wang K， Jin Y， et al. Endoplasmic reticulum proteostasis control and gastric cancer. Cancer Lett， 2019（449）：263-271.

[收稿日期：2019-03-20]