引發(fā)對(duì)老化大麥種子可溶性物質(zhì)及抗氧化酶活性的影響

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 新疆 石河子 832003)

蛋白質(zhì)和糖類是種子中最主要的貯藏物質(zhì)[1]。糖類為胚的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源，促進(jìn)種子萌發(fā)[2]?？扇苄蕴鞘侵参锷L(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[3]，它不僅是能量來(lái)源和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且在信號(hào)傳導(dǎo)中具有類似激素的初級(jí)信使作用[4]，參與植物體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)，保證細(xì)胞的正常生理功能[5]。蛋白質(zhì)包括貯藏蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，是種子中重要的營(yíng)養(yǎng)成分，并控制和調(diào)節(jié)遺傳物質(zhì)[6]。植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，可溶性蛋白含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)[7-8]。超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。種子老化處理后種子胚中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性以及過(guò)氧化氫酶活性都會(huì)發(fā)生不同程度的變化，引發(fā)處理后這些指標(biāo)也會(huì)發(fā)生改變[9]。本研究采用人工加速老化法對(duì)甘啤4號(hào)大麥種子進(jìn)行處理，采用PEG和CaCl2引發(fā)處理，測(cè)定種子胚中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、CAT活性的變化，篩選出最優(yōu)引發(fā)試劑，為大麥種子貯藏和生產(chǎn)實(shí)踐上活力的保持提供科學(xué)參考。

圖1 老化和引發(fā)對(duì)甘啤4號(hào)種子吸脹過(guò)程中可溶性糖含量的影響

1 材料與方法

1.1 材 料

選取甘啤4號(hào)大麥種子為實(shí)驗(yàn)材料，于2017年7月采自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)站，保存于-20 ℃種子庫(kù)。

1.2 種子人工老化處理

種子人工老化采用高溫(40 ℃)、高濕(相對(duì)濕度80%)老化法[10]。

1.3 種子引發(fā)處理

挑選經(jīng)老化處理后飽滿、大小均勻一致的大麥種子適量，經(jīng)消毒后沖洗干凈待用。

PEG引發(fā)：取上述處理后的種子適量分別放于燒杯中，加入配制好的PEG溶液中引發(fā)，PEG設(shè)置0、10%、20%、30%這4種濃度，引發(fā)12 h、24 h、36 h。

CaCl2溶液中引發(fā)：設(shè)置0、5、10、15 mg·L-1這4種濃度，引發(fā)12 h、24 h、36 h。將種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24 h，取出后用蒸餾水沖洗干凈，室溫下回干備用。

1.4 測(cè)定方法

可溶性糖含量采用蒽酮比色法[11]，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[12]，SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[13]，POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[14]，CAT活性的測(cè)定采用比色法[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的計(jì)算，SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，多重比較采用Duncans法進(jìn)行，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引發(fā)對(duì)大麥種子可溶性糖含量的影響

由圖1可見，隨老化時(shí)間延長(zhǎng)，干種子胚中可溶性糖含量也顯著降低。4種不同活力類型的種子在吸脹24 h時(shí)種子胚中可溶性糖含量最低，吸脹72 h時(shí)老化0 d、3 d和6 d的種子胚中可溶性糖含量最高，而老化9 d的種子在吸脹48 h時(shí)種子胚中可溶性糖含量達(dá)到最高，為72.54 mg·g-1(FW)。由此可知，吸脹時(shí)間和老化時(shí)間都會(huì)影響甘啤4號(hào)大麥種子胚中可溶性糖含量。

對(duì)老化9 d的甘啤4號(hào)大麥種子來(lái)說(shuō)，隨吸脹時(shí)間增加，種子胚中可溶性糖含量呈先緩慢降低，再緩慢升高，最后迅速降低的變化趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，隨吸脹時(shí)間增加，老化種子胚中可溶性糖含量呈先緩慢降低后緩慢升高，最后又迅速升高的變化趨勢(shì)。吸脹72 h時(shí)種子胚中可溶性糖含量比對(duì)照高5 mg·g-1(FW)和3 mg·g-1(FW)。由此可知，引發(fā)處理后甘啤4號(hào)大麥種子胚中可溶性糖含量升高，并且20% PEG引發(fā)效果明顯優(yōu)于10 mg·L-1CaCl2引發(fā)。

2.2 引發(fā)對(duì)大麥種子可溶性蛋白含量的影響

由圖2可見，隨老化時(shí)間延長(zhǎng)，種子胚中可溶性蛋白含量也顯著降低。由圖2可知，吸脹時(shí)間和老化時(shí)間都會(huì)影響甘啤4號(hào)大麥種子胚中可溶性蛋白含量。

對(duì)老化9 d的甘啤4號(hào)大麥種子來(lái)說(shuō)，隨吸脹時(shí)間增加，種子胚中可溶性蛋白含量呈先緩慢降低、再緩慢升高、最后又緩慢降低的變化趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)20% PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，老化種子胚中可溶性蛋白含量顯著升高，明顯高于對(duì)照。20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，吸脹0 h時(shí)種子胚中可溶性蛋白含量明顯高于對(duì)照，吸脹72 h時(shí)反而低于對(duì)照，說(shuō)明引發(fā)效果受到吸脹時(shí)間的影響，所以在引發(fā)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制吸脹時(shí)間。由此可知，引發(fā)處理后甘啤4號(hào)大麥種子胚中可溶性蛋白含量升高，并且20% PEG引發(fā)效果明顯優(yōu)于10 mg·L-1CaCl2引發(fā)。

圖2 老化和引發(fā)對(duì)甘啤4號(hào)種子中可溶性蛋白含量的影響

圖3 老化和引發(fā)對(duì)甘啤4號(hào)種子吸脹過(guò)程中超氧化物歧化酶活性的影響

2.3 引發(fā)對(duì)大麥種子SOD活性的影響

由圖3可見，隨老化程度加深，種子中SOD活性降低，說(shuō)明老化降低了甘啤4號(hào)大麥種子中SOD活性，而且吸脹時(shí)間也顯著影響種子中SOD活性。

對(duì)老化9 d的甘啤4號(hào)大麥種子來(lái)說(shuō)，隨吸脹時(shí)間增加，種子中SOD活性呈先降低再升高的變化趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)20% PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，老化種子中SOD活性顯著升高，明顯高于對(duì)照。這說(shuō)明引發(fā)效果受到吸脹時(shí)間的影響，所以在引發(fā)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制吸脹時(shí)間。由此可知，引發(fā)處理后甘啤4號(hào)大麥種子中SOD活性升高。

2.4 引發(fā)對(duì)大麥種子POD活性的影響

由圖4可見，隨老化程度加深，種子中POD活性降低。對(duì)老化9 d的大麥種子來(lái)說(shuō)，隨吸脹時(shí)間增加種子中POD活性呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，吸脹24 h時(shí)POD活性最高，為10.65 mg·(g·min)-1，吸脹12 h時(shí)POD活性最低，為7.72 mg·(g·min)-1。由此可知老化降低了甘啤4號(hào)大麥種子中POD活性，而且吸脹時(shí)間也顯著影響種子中POD活性。

對(duì)低活力甘啤4號(hào)大麥種子，隨吸脹時(shí)間增加，種子中POD活性呈先降低后持續(xù)上升的變化趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，老化種子中POD活性顯著升高，明顯高于對(duì)照。20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，吸脹12 h時(shí)種子中POD活性分別比對(duì)照增加4.8 mg·(g·min)-1和4.62 mg·(g·min)-1；當(dāng)種子吸脹24 h時(shí)種子中POD活性分別比對(duì)照增加2.11 mg·(g·min)-1和2.3 mg·(g·min)-1，這說(shuō)明引發(fā)效果受到吸脹時(shí)間的影響，所以在引發(fā)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制吸脹時(shí)間。由此可知，引發(fā)處理后甘啤4號(hào)大麥種子中POD活性升高。

2.5 引發(fā)對(duì)大麥種子CAT活性的影響

由圖5可見，隨老化程度加深，種子中CAT活性降低。對(duì)老化9 d的大麥種子來(lái)說(shuō)，隨吸脹時(shí)間增加種子中CAT活性呈先升高后降低最后又升高的變化趨勢(shì)，吸脹12 h時(shí)CAT活性最高，為5.98 mg·(g·min)-1，吸脹18 h時(shí)CAT活性最低，為5.12 mg·(g·min)-1。老化降低了甘啤4號(hào)大麥種子中CAT活性，而且吸脹時(shí)間也顯著影響種子中CAT活性。

隨吸脹時(shí)間增加，低活力種子中CAT活性呈先升高后降低最后又升高的變化趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，老化種子中CAT活性顯著升高，明顯高于對(duì)照。20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)處理后，吸脹6 h時(shí)種子中CAT活性分別比對(duì)照增加2.28 mg·(g·min)-1和1.2 mg·(g·min)-1；當(dāng)種子吸脹24 h時(shí)種子中CAT活性分別比對(duì)照增加1.98 mg·(g·min)-1和1.72 mg·(g·min)-1，這說(shuō)明引發(fā)效果受到吸脹時(shí)間的影響，所以在引發(fā)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制吸脹時(shí)間。由此可知，引發(fā)處理后甘啤4號(hào)大麥種子中CAT活性升高。

圖4 老化和引發(fā)對(duì)甘啤4號(hào)種子吸脹過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性的影響

圖5 老化和引發(fā)對(duì)甘啤4號(hào)種子吸脹過(guò)程中過(guò)氧化氫酶活性的影響

表1 大麥種子發(fā)芽指標(biāo)與貯藏物質(zhì)和部分酶活性的相關(guān)性分析

品種指標(biāo)可溶性糖可溶性蛋白SODPODCAT甘啤4號(hào)GR0.996**0.9470.966*0.962*0.887GP0.987*0.980*0.994**0.9470.946GI0.973*0.8320.8970.996**0.828VI0.976*0.9370.9390.9240.838

注：*表示0.05水平上相關(guān)(雙尾)，**表示在0.01水平上相關(guān)(雙尾)。下同。

2.6 大麥種子發(fā)芽指標(biāo)與貯藏物質(zhì)和部分酶活性的相關(guān)性分析

由表1可知，大麥種子發(fā)芽指標(biāo)與可溶性糖、可溶性蛋白、SOD、POD和CAT之間存在相關(guān)性。對(duì)甘啤4號(hào)大麥種子來(lái)說(shuō)，GR與可溶性糖呈極顯著正相關(guān)，與SOD、POD呈顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

可溶性糖作為種子萌發(fā)的能源物質(zhì)，參與植物滲透壓的調(diào)節(jié)，保證細(xì)胞的正常生理功能。植物中的大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)是參與各種代謝的酶。而且，可溶性蛋白質(zhì)是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。老化處理顯著降低了種子中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量[17-18]。在本試驗(yàn)中，甘啤4號(hào)大麥種子可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量隨著老化程度的增加而顯著降低，隨吸脹時(shí)間增加，高活力和中活力種子胚中可溶性物質(zhì)總體呈先緩慢降低，再緩慢升高，最后迅速升高的變化趨勢(shì)，而低活力種子胚中可溶性物質(zhì)整體呈先緩慢降低后緩慢升高最后又迅速降低的變化趨勢(shì)。吸脹時(shí)間和老化時(shí)間均影響大麥種子胚中的可溶性物質(zhì)含量。引發(fā)處理后可溶性物質(zhì)含量都有不同程度的提高，且含量顯著高于對(duì)照，尤其低活力種子引發(fā)效果最顯著。這可能是過(guò)氧化作用產(chǎn)生的物質(zhì)使細(xì)胞受到損壞[19]，加速了貯藏物質(zhì)的降解[20]，也可能是老化加速了種子的呼吸代謝[21]，進(jìn)而加速了可溶性糖和可溶性蛋白的利用消耗[22-23]。另外，老化抑制了蔗糖的轉(zhuǎn)化和可溶性糖的代謝，并且種子萌發(fā)沒(méi)有足夠的能量供應(yīng)和原料，繼而影響種子活力[24]。Rajjou等研究表明，種子在貯藏過(guò)程中因貯藏條件的變化導(dǎo)致種子中蛋白質(zhì)含量發(fā)生改變，低活力種子蛋白的合成被阻斷，導(dǎo)致種子劣變和活力降低[25]。因此，蛋白質(zhì)的含量顯著影響種子的活力。王自霞發(fā)現(xiàn)，隨著衰老的加深，種子中SOD、POD和CAT活性顯著降低[9]，這與本研究結(jié)果相同，老化處理后大麥種子中SOD活性、POD活性和CAT活性顯著下降，引發(fā)處理后3種酶活性明顯增加，而且引發(fā)效果根據(jù)活力水平、吸脹時(shí)間以及大麥品種的不同而發(fā)生很大變化。

本研究結(jié)果表明，引發(fā)處理顯著提高了甘啤4號(hào)大麥種子的可溶性糖和可溶性蛋白含量，而且引發(fā)后甘啤4號(hào)大麥種子胚中SOD、POD和CAT酶活性均有不同程度的提升。引發(fā)效果不僅與引發(fā)濃度和引發(fā)時(shí)間密切相關(guān)，還與引發(fā)過(guò)程中吸脹時(shí)間有關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中，20%PEG和10 mg·L-1CaCl2引發(fā)24 h效果最顯著。結(jié)果可這為大麥種子貯藏和生產(chǎn)實(shí)踐上活力的保持提供參考。