脂肪間充質干細胞治療慢性阻塞性肺疾病的實驗研究

黃志昂 尚 艷 劉方方 賽亞飛 路武杰 馮志軍

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以氣流受限為主要特征的慢性呼吸系統疾病，其病情常呈進行性進展，患病率及病死率較高，嚴重危害患者身體健康，已成為一個重要的公共衛生問題［1］。COPD主要累及肺臟，病因較為復雜，炎癥反應被認為是其主要發病機制，但目前尚未找到有效治療方案［2］。干細胞是一類能特異性分化成各種組織器官的細胞，目前臨床上以被應用于多種疾病的治療中，其中脂肪間充質干細胞（amniotic-derivedmesenchymalstem cells，ADMSCs）因具有強大自我更新能力及分化潛能，業已成為再生醫學及組織工程學應用較多的理想種子細胞［3］。研究證明，干細胞移植對多種肺損傷均有較好的修復作用［4，5］，但 ADMSCs治療肺疾病方面的研究較少。本研究采用熏香煙加氣管注入內毒素誘導的COPD大鼠模型為實驗對象，將培養ADMSCs移植到模型鼠肺臟組織內，觀察外源性的ADMSCs對模型鼠肺臟組織的病理和生化指標的影響，藉以探究 ADMSCs在COPD治療中的價值，為臨床治療COPD另辟思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1COPD模型的制備與分組 取健康SPF級雄性SD大鼠60只，體重（220±20）g（由上海斯萊克實驗動物有限公司提供），將其隨機分對照組、治療組及模型組，治療組和模型組大鼠進行COPD模型的制備，對照組不進行造模。取40只SPF大鼠，給予生理鹽水 10 ml/（kg·d）灌胃 4周后開始建模，于建模第 1、14 d經氣管注入2 g/2l內毒素（Sigma）200μl，第2～30 d（第14 d除外）將大鼠置入有機玻璃倉內，注入過濾嘴香煙煙霧，0.5 h/d，每天以生理鹽水灌胃，以大鼠出現頻繁咳嗽癥狀作為判斷造模成功的標準。

1.2ADMSCs的分離、培養 另取健康SPF級雄性SD大鼠2只，頸椎脫臼法處死，分離附睪及腹股溝處脂肪組織，PBS沖洗后剪碎，取少量置于離心管內，加入膠原酶混勻，于37℃消化2 h，加入低糖DMEM培養基，混勻后離心10 min，棄上清液，PBS沖洗2遍，加入完全培養基，混勻后吸取少量懸浮液接種于培養基中，37℃培養；體積分數5%時轉入CO2培養箱培養，培養至細胞達80%～90%融合時，加入胰酶消化，按1∶2比例傳代培養；于第3代細胞融合達80%時加入含溴氮胞苷（BrdU），37℃孵育30 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況，消化細胞傳代培養。使用免疫組化技術、細胞表面特異性標志物鑒定體外培養的ADMSCs及誘導分化的細胞。

1.3ADMSCs的移植 造模成功后1周，對照組及模型組大鼠經尾靜脈注射0.5 ml生理鹽水，治療組大鼠尾靜脈注射0.5 ml BrdU標記的ADMSCs懸液。

1.4觀察指標

1.4.1 肺功能 用小動物肺功能測定儀測定各組大鼠1 s時間用力呼出量（FEV1）及其與用力肺活量之比（FEV1/FVC）、最大呼氣中期流速（MMEF）、最大呼氣流量（PEF）等。

1.4.2炎癥因子水平測定 細胞移植后14 d時，打開大鼠胸腔，使氣管及雙肺暴露，切開氣管，血管鉗夾閉右側主支氣管支，左肺注入生理鹽水進行灌洗，停留數秒后抽出灌洗液，離心棄去上清液備用。吸取灌洗液滴入細胞計數板，低倍鏡視野下計數；另取少量細胞涂片及瑞氏染色，選取細胞計數板上的白細胞，根據細胞形態分類計數，計算各種白細胞百分率。采用酶聯免疫吸附法測定灌洗液中白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、及C反應蛋白（CRP）水平。試劑盒由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，實驗操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4.3病理變化 取大鼠右肺，多聚甲醛固定、石蠟包埋切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察。每例選擇3張切片，隨機選取5個視野，避開支氣管及大、中型血管，觀測下列指標：

1）肺泡間隔數（MLI）：以每個視野正中為中心作“+”字交叉線，計數經此“+”字線的肺泡間隔數，測定+字線長度；肺平均內襯間隔（MLI）=肺泡間隔數/“+”字線長度。

2）單位面積肺泡數（MAN）：視野里的肺泡數除以視野的面積。

3）平均肺泡面積（MAA）：MAA=（每個視野的面積-HE染色陽性區域面積）/肺泡數。

1.5統計學分析 所有數據采用SPSS 22.0進行統計學分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ADMSCs培養結果 ADMSCs原代培養后可見貼壁細胞，培養6 d后細胞呈梭形；3代培養后形態均一，呈長梭形，細胞見可見脂滴存在（見封三圖1）。

2.2各組肺功能指標的比較 與對照組比較，模型組和治療組肺功能指標均顯著下降（P＜0.05），而治療組肺功能優于模型組（P＜0.05）。見表1。

2.3各組白細胞及免疫相關指標的比較 模型組和治療組肺泡灌洗液中白細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數及IL-8、TNF-α、CRP水平均顯著高于對照組（P＜0.05），治療組各免疫細胞數及免疫相關指標水平均顯著低于模型組（P＜0.05）。見表2、3。

2.4各組肺組織病理變化 模型組、治療組肺組織切片均可見COPD病理性變化，治療組較模型組肺氣腫病理改變輕（見封三圖2）。各組肺組織MLI、MAN、MAA比較差異具統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表1 各組肺功能指標的比較x±s

表1 各組肺功能指標的比較x±s

與對照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n FEV1（L） FEV1/FVC（%） MMEF（L/s） PEF（L/s ）對照組20 2.18±0.22 82.89±3.25 1.88±0.21 4.92±0.13模型組 20 0.98±0.15* 40.66±4.26* 0.89±0.22* 3.98±0.21*治療組 20 1.67±0.25*# 69.09±2.99*# 1.42±0.19*# 4.44±0.11*#

表2 各組白細胞及其相關分類的比較±s

表2 各組白細胞及其相關分類的比較±s

組別 n 白細胞（×109/L） 巨噬細胞（%） 中性粒細胞（%）對照組20 2.36±0.47 1.58±0.29 6.99±1.26模型組 20 6.27±1.01* 3.26±0.45* 26.79±1.69*治療組 20 3.98±0.28*# 2.27±0.29*# 14.37±1.35*#

表3 各組免疫相關指標的比較±s

表3 各組免疫相關指標的比較±s

與對照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n IL-8（ng/L） TNF-α（g/L） CRP（ng/L）對照組20 24.37±2.49 20.38±3.56 2.38±0.39模型組 20 55.89±3.27* 69.39±4.22* 20.31±4.28*治療組 20 33.38±2.33*# 34.70±3.61*# 8.92±1.33*#

表4 各組肺組織病理指標的比較±s

表4 各組肺組織病理指標的比較±s

與對照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n MLI（μm） MAN（106/m2） MAA（μm2）對照組20 58.38±8.22 398.45±20.48 4980.33±389.48模型組 20 88.39±9.01* 201.33±23.82* 8189.24±478.56*治療組 20 66.07±3.57*# 325.39±24.28*# 5827.33±390.45*#

3 討論

研究認為，COPD的發病機制主要以炎癥的級聯反應為主要特征，炎癥細胞的聚集、活性氧及蛋白水解酶類釋放，以及蛋白酶的水解和氧化損傷的發生，導致不可逆的上皮細胞凋亡及小氣道壁受損、肺泡腔擴大，最終導致COPD的發生。目前COPD主要以消除炎癥、擴張支氣管等緩解癥狀的治療，尚無有效逆轉肺損傷的治療方式。因此，尋找修復肺部組織結構的有效方法是從根本上治療COPD的關鍵措施。

間充質干細胞是具有一定更新能力及多向分化潛能的成體干細胞，在適宜情況下可向多種中胚層及神經外胚層來源的組織細胞分化。目前臨床上骨髓間充質干細胞應用較廣。近年來研究表明，脂肪組織中同樣具有大量間充質干細胞，具有體外增值及多重分化的潛能，可用于組織和器官的再生與修復。相較于其他間充質干細胞，ADMSCs的取材較為簡單，脂肪中的間充質干細胞含量豐富，且ADMSCs免疫源性較低，可減少移植的排斥反應，臨床引用價值較大。研究認為，脊髓間充質干細胞在體內、外可分化為肺上皮細胞，促進肺組織的再生。另外，其還可分泌細胞因子及生長因子等多種生物活性物質，抑制肺組織的凋亡，改善組織損傷部位及微環境，為損傷的修復提供有利的環境，有利于COPD的治療，但ADMSCs在COPD臨床治療研究報道尚少。

本研究采用熏香煙加氣管注入內毒素方法誘導大鼠建立COPD模型后，比較對照組與模型組大鼠肺功能、炎癥因子及病理切片情況，顯示模型組肺功能顯著低于對照組，其炎癥因子水平均顯著升高，病理切片示顯著的肺水腫征象，提示本研究COPD建模情況較好，建模大鼠均出現COPD相關癥狀及病理診斷征象，也進一步提示炎癥反應是COPD發生發展的重要因素之一。

為探究ADMSCs對COPD肺損傷的作用，比較采用ADMSCs移植治療的大鼠和未行ADMSCs移植治療大鼠的肺部功能及相關炎癥指標，結果顯示，治療組肺功能顯著優于模型組，且相關炎癥因子水平均顯著低于建模組，證實 ADMSCs可一定程度上改善COPD大鼠的肺功能，并降低炎癥因子的表達。

研究表明，TNF-α可直接損傷毛細血管內皮細胞，聚集、黏附及激活中心粒細胞，使中性粒細胞產生大量的氧自由基，加速肺臟損傷，而IL-8等炎癥因子均可對TNF-α起到重要的協同作用。本研究顯示ADMSCs可明顯降低相關炎癥因子的表達，進而緩解COPD的相關癥狀。對各組肺部病理切片分析發現，治療組較模型組肺氣腫病理改變輕，提示ADMSCs可促進肺損傷的修復。研究表明，間充質干細胞可分泌多種細胞保護和修復作用的生長因子，可刺激血管生成、抑制纖維化及細胞凋亡。本研究結果提示，ADMSCs可能具有類似的作用，起到減輕肺組織細胞凋亡，促進肺受損部位修復的功效。吳林等［6］探究小鼠ADMSCs對減緩百草枯重度引起的肺損傷的作用效果，顯示ADMSCs治療組小鼠血漿中的TNF-α、IL-1β的含量顯著低于未治療組，且肺組織病理染色示ADMSCs治療組肺組織纖維化程度顯著低于未治療組；常鵬宇等［7］也證實人脂肪來源間充質干細胞可抑制放射性肺纖維化進展，對肺組織有一定的保護作用。本研究進一步證實ADMSCs對COPD大鼠肺損傷也有一定的治療作用。

綜上，ADMSCs移植治療可顯著改善COPD大鼠肺組織的病理性改變，減輕炎癥反應，改善肺功能，具有一定的治療作用。