凍干濃縮對高效液相色譜法測定杭椒類辣椒中辣椒素類物質的影響

呂曉菡 楊靜 陳建瑛 傅鴻妃 祝彪 聶智星

摘要?[目的]研究冷凍干燥和濃縮等技術在辣椒特別是低辣辣椒果實中辣椒素類物質檢測中的應用。[方法]選取不同辣度的4種辣椒果實為試驗材料，分析烘干/冷凍干燥、濃縮/不濃縮等前處理方式對高效液相色譜法測定辣椒素類物質的影響。[結果]采用冷凍干燥技術不僅能去除鮮辣椒中水分而且最大程度保留其活性物質，較烘干技術果實中的辣椒素和二氫辣椒素損失減少，同時解決了大批量測定分析時，鮮辣椒無法長期保存的問題。提取過程中采用濃縮提取方法，解決了樣品量少、樣品辣椒素含量過低時無法獲得準確數據的難題。另外，還利用該方法對辣椒素含量較低的杭椒類辣椒果實中辣椒素的變化規律進行研究，發現當辣椒果實進入成熟期后在前期辣椒素含量與果實成熟度呈正相關，但在成熟期后期即開花48 d后果實中的辣椒素含量有所下降。[結論]該研究為辣椒素的氧化及轉化過程提供參考依據。

關鍵詞?凍干;濃縮;高效液相色譜法;辣椒素類物質;杭椒類辣椒

中圖分類號?TS255文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0196-04

Abstract?[Objective] The research aimed to study the application of freezedrying and concentration techniques in the detection of capsaicinoids in peppers，especially in lowspicy pepper fruits.[Method] Fruits of four capsicum strains with different spicy degrees were used to explore the effects of pretreatment method （dry methods and concentrate） in capsaicinods determination by HPLC.[Result]The freeze drying technology could not only remove the water in fresh chili，but also retain its active substance to the maximum extent.The loss of capsaicin and two capsaicin in the fruit of drying technology was reduced.At the same time，the problem that fresh pepper could not be stored for a long time was solved in mass determination and analysis.During the extraction process，concentration extraction method was used to solve the problem that the sample size was too small and the capsaicin content was too low to obtain accurate data.In addition，the variation of capsaicin in capsicum fruits with low capsaicin content was studied by using this method.The results showed that the capsaicin content in the early stage was positively related to the maturity of the fruit，but the capsaicin content in the fruit decreased after 48 days of flowering.[Conclusion] This study provides a reference for the oxidation and transformation process of capsaicin.

Key words?Freeze dying;Concentrate;High performance liquid chromatography （HPLC）;Capsaicinoids;Pepper

辣椒作為一種重要的蔬菜，在全世界 60 多個國家和地區均有種植，是一種世界性的蔬菜[1-2]。杭椒類辣椒是杭州及周邊地區傳統優勢辣椒品種，以其嫩果微辣或不辣，老熟果辣味漸濃的特色被廣大消費者喜愛。隨著市場的不斷擴大，人們對“辣味”細化的要求也有所提高，已成為杭椒類辣椒育種工作的新熱點。所謂辣椒的“辣味”，是人們食用辣椒及其制品后，辣椒素結合人體痛覺途徑中的辣椒素受體而產生的灼痛感[3]。習慣上所稱的辣椒素是辣椒素類物質（capsaicinoid）的混合物，為辣椒果實所特有[4]。辣椒素類物質主要包含辣椒素（capsaicin，CAP）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin，DCAP）、高辣椒素（homocapsaicin）、高二氫辣椒素（homodihydrocapsaicin）、降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）。其中辣感的主要來源是辣椒素和二氫辣椒素，占辣椒素類物質總含量的90%以上[5-7]，因此這2種辣椒素類物質也是辣味水平研究的主要對象。

目前，辣椒素和二氫辣椒素的提取方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶法提取等，其中溶劑提取法是國內最常見的提取方法之一[8-10]。山東凱斯達機械制造有限公司的“萃取辣椒紅色素及辣椒素的方法”（CN 102516802 A）用得就是正己烷和丙酮混合劑進行萃取[11];超臨界CO2提取法和微波提取法效果雖好但需要昂貴的設備，如浙江中味釀造有限公司“一種利用超臨界CO2流體從黃櫻椒中萃取出辣椒素的方法”（CN 101735092 A）用的就是超臨界CO2提取法[12]。此外，傳統辣椒素提取技術采用烘干樣品，或者直接使用鮮樣進行提取，過程中操作復雜，辣椒素損失較大。

在用傳統辣椒素檢測方法檢測杭椒類辣椒素時，常常因為樣品量少、辣椒素含量過低等原因，無法正常獲得準確數據，還存在提取過程中溶劑損耗較多、提取操作繁瑣、費時費力等問題。因此，該研究針對傳統辣椒素檢測方法過程復雜、損失較大的問題，將凍干、濃縮等新技術引入到辣椒素的檢測中來，探索一種結合冷凍干燥技術、濃縮提取和高效液相色譜-紫外檢測器分析技術檢測杭椒等低辣度辣椒樣品中辣椒素和二氫辣椒素含量的新方法，另外，對辣椒果實不同生長時期辣椒素含量進行分析，初步探討辣椒果實中辣味的變化規律。

1?材料與方法

1.1?儀器與設備

真空冷凍干燥機、樣品粉碎機、通風柜、超聲波儀、高效液相色譜儀、萬分之一電子天平、高速離心機。250?mL量筒、500?mL廣口瓶、2 L廣口瓶、10?mL容量瓶、10?mL 離心管、10?mL玻璃試管、2?mL針筒、2 mL進樣瓶、0.45 μm有機溶劑過濾膜。

1.2?試劑

甲醇（色譜純）、四氫呋喃（色譜純）、辣椒素標品（97.5%）和二氫辣椒素標品（98.9%）。提取劑為甲醇與四氫呋喃（1∶1）混合液。

1.3?樣品的制備

供試辣椒材料為4種辣椒不同的辣椒材料，樣品A為杭椒3（微辣），樣品B為杭椒2（中辣），樣品C為永黃-17（中辣），樣品D為750-25-1（高辣），均來自杭州市農業科學院。

1.4?樣品前處理

1.4.1?凍干。

以新鮮辣椒作為待測樣品，將待測樣品用液氮處理（處理方式為將鮮辣椒對半剖開，放入塑料網袋，浸沒于液氮中預凍）15～30 s后放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥至含水率≤0.5%;真空度為0.57～0.62 mPa;冷凍溫度為-60～-55 ℃，冷凍干燥時間約為72 h以上。

1.4.2?磨粉。

冷凍干燥后辣椒用樣品粉碎機粉碎至過50目篩;裝入自封袋中，低溫保存備用（-20 ℃）。

1.4.3?提取。

精確稱取2 g 辣椒粉末，于10 mL離心管中加入4 mL甲醇-四氫呋喃溶液，超聲提取30 min，放入高速離心機中10 000 r/min離心10?min，上層清液移至10 mL容量瓶中，再重復操作2次，合并 3 次提取液，甲醇-四氫呋喃溶液定容，混勻。

1.4.4?濃縮。所得的提取液于10?mL玻璃試管，在通風櫥內60 ℃水浴蒸發至1?mL，0.45 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜進行分析。

1.5?色譜分析條件?色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.0 mm，5 μm）;流動相為80%甲醇;流速為0.8 mL/min;紫外波長280 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。

1.6?辣椒果實不同成熟期辣椒素含量的變化

選取6份杭椒類辣椒材料（HJ001～HJ006）在大致相同時期內完全開放的花朵進行標記，每重復標記50朵，花后15 d開始，每間隔7 d采摘5個標記果，共采集5次。然后用該研究中的方法檢測不同成熟期的辣椒果實中辣椒素的含量。

2?結果與分析

2.1?標準曲線的繪制?取適量的辣椒素和二氫辣椒素的標準品，用甲醇逐級稀釋成質量濃度為0.015 625、0.031 250、0.063 500、0.125 000、0.250 000 mg/mL 濃度梯度的標準溶液，再依次進行色譜分析，可得標準樣品溶液的MRM圖（圖1）及辣椒素和二氫辣椒素標準曲線。

由圖2、3可知，辣椒素和二氫辣椒素濃度在0～0.3 mg/mL與峰面積呈現良好的線性關系，其中辣椒素的線性方程為y=11 440x+6.570 8（R2=0.999 8），二氫辣椒素的線性方程為y=13 414x-4.225（R2=1.000 0）。這說明用高效液相色譜法檢測辣椒素和二氫辣椒素具有良好的線性和范圍。

2.2?凍干對高效液相色譜法檢測辣椒素和二氫辣椒素的影響

分別選取微辣、中辣、高辣的3份樣品即樣品A、樣品C、樣品D。分別用凍干和烘干（60 ℃烘干至含水率≤0.5%）2種方法處理新鮮樣品，其余方法相同，檢測辣椒素和二氫辣椒素，每種樣品重復3次，結果如表1所示。

從表1可以看出，采用凍干或烘干2種不同的樣品前處理方法后，微辣、中辣、高辣的樣品都測得了辣椒素和二氫辣椒素的數據，且凍干后獲得的數據明顯高于烘干后獲得的數據，說明采用冷凍干燥技術去除鮮辣椒中水分能最大程度保留其活性物質，較其他干燥方法辣椒素的損失減少。

2.3?濃縮對高效液相色譜法測辣椒素和二氫辣椒素的影響

分別選取微辣1份（樣品A）、中辣2份（樣品B和C）、高辣1份（樣品D）總計4份樣品，分別用濃縮和不濃縮的方法處理樣品提取液，其他方法相同，進行檢測，所得結果如表2所示。由表2可知，大部分樣品在濃縮處理后測得的辣椒素和二氫辣椒素與不濃縮測得的濃度值沒有明顯的區別，并未達到顯著差異，說明對樣品進行濃縮處理不會對檢測結果造成影響，然而對于樣品A這樣的低辣度樣品而言，不濃縮根本無法獲得檢測數據。

2.4?不同比例流動相對色譜檢測的影響

將“1.5”試驗方法中的流動相分別設置為60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇，其余等同。取樣品A進行檢測，獲得辣椒素和二氫辣椒素的HPLC色譜圖（圖4）。由圖4和表3可見，將100%甲醇作為流動相時，色譜圖中辣椒素和二氫辣椒素無法分開;相對于60%甲醇，采用80%甲醇作為流動相時，樣品中辣椒素和二氫辣椒素的分離度更高、儀器響應也更好。表明80%甲醇為三者中的最佳選擇。

2.5?加標回收試驗

稱取已知辣椒素含量為0.07 mg/g的杭椒（3#）凍干樣2 g，加入1 mg/mL辣椒素標準溶液150 μL后按照“1.4”方法進行提取，重復5次。同時稱取3份2 g相同的杭椒凍干樣用做平行分析，最終獲得樣品含量平均值為0.064 75 mg/g。按照加標回收率的計算公式進行計算，所得結果如表4所示。

稱取已知二氫辣椒素含量為0.06 mg/g的750-25-1凍干樣2 g，加入1 mg/mL辣椒素標準溶液120 μL后按照“1.4”方法進行提取，重復5次。同時稱取3份2 g相同的750-25-1凍干樣用做平行分析，最終獲得樣品含量平均值為0.067 70 mg/g。按照加標回收率的計算公式進行計算，所得結果如表5所示。

由表4～5可知，使用凍干濃縮的方法來檢測各辣椒樣品果實中的辣椒素和二氫辣椒素，其回收率均達到97.73%以上。說明用上述方法來檢測辣椒果實中的辣椒素和二氫辣椒素是準確可行的。

2.6?不同成熟期的杭椒類辣椒果實中辣椒素的變化規律

對各個材料5個不同時期的鮮辣椒果實中辣椒素含量進行數據分析（表6），發現6個供試材料鮮果實中辣椒素含量在開花后的20～41 d都在不斷上升，而在開花后48 d后都出現了不同程度的下降。這說明在果實不斷成熟的過程中，體內的辣椒素含量不是一直與成熟度成正比，而是在后期會出現下降。

3?討論與結論

高效液相色譜法是目前較為普遍和精準的檢測辣椒素和二氫辣椒素的方法[13-15]，然而，在檢測諸如杭椒類辣椒時，由于樣本量少、辣椒素含量低等問題無法正常檢出。該研究中，將冷凍干燥和濃縮這2種技術引入到高效液相色譜法檢測辣椒素和二氫辣椒素中。研究表明，采用冷凍干燥技術不僅能去除鮮辣椒中水分，而且最大程度保留其活性物質，較烘干技術果實中的辣椒素和二氫辣椒素損失減少，同時解決了大批量測定分析時鮮辣椒無法長期保存的問題;提取過程中采用濃縮提取方法，解決了樣品量少、樣品辣椒素含量過低時無法進行準確測定的難題。另外，檢測采用反相高效液相色譜結合DAD紫外檢測器，采用C18反相色譜柱，用80%甲醇為流動相，加標回收率97.73%～100%。這充分說明將凍干和濃縮2項技術引入高效液相色譜中，不但減少了辣椒素和二氫辣椒素的損失，使杭椒類辣椒果實中的辣椒素和二氫辣椒素能正常檢出，而且不影響檢測結果的準確率。

在運用該研究的檢測方法檢測不同成熟期杭椒類辣椒果實中辣椒素的含量時發現，當辣椒果實進入成熟期后在前期辣椒素的含量與果實的成熟度呈正相關，但在成熟期后期即開花48 d后果實中的辣椒素含量有所下降。這可能與過氧化酶和辣椒素共同定位于胎座表皮細胞的液泡和細胞壁中有關，成熟期后期過氧化酶活性不斷升高，參與了辣椒素的氧化，使辣椒素轉化為其他次生產物。具體的氧化及轉化過程還需進一步研究。

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