固定假絲酵母脂肪酶candida rugosa lipase

周蕊 邢炎華 王燕

摘 ?????要：以殼聚糖-戊二醛（Chitosan-GA）為載體固定假絲酵母脂肪酶candida rugosa lipase（CRL）最高酶活可達(dá)240 μ·g-1。Chitosan-GA固定化酶循環(huán)使用4次后保留了20%左右的初始酶活力。固定化酶在水相中保存185 d后保留了40%以上初始酶活力。固定化酶在有機(jī)溶劑（正庚醇）中浸泡120 h后固定化酶酶活保留32.2%，而游離酶只保留原始酶活的8.5%。Chitosan-GA載體固定化脂肪酶在水相和有機(jī)相中的保存穩(wěn)定性都好于游離酶。

關(guān) ?鍵 ?詞：殼聚糖;假絲酵母;初始酶活力;固定化

中圖分類號(hào)：O629.8 ???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)：1671-0460（2019）08-1686-04

Abstract： Chitosan support was synthesized by coupling glutaraldehyde （Chitosan-GA） onto the surface. And then candida rugosa lipase（CRL） was immobilized on this support. The highest activity of immobilized lipase was 240 μ·g-1. The immobilized lipase remained 20% of initial activity even after 4 times of reuse. The drop in the activity of the immobilized lipase after 185 days storage at 4 ℃ did not exceed 60%. Immobilized enzyme is much more stable than free enzyme in aqueous phase and organic phase.Key words： Chitosan; Candida mycoderma; Initial enzyme activity; Immobilization

固定化酶是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，酶仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)[1，2]。與游離酶相比，固定化酶具有更多優(yōu)點(diǎn)[3]。

酶的“柔性固定化”就是在固定化載體上，接上一些有足夠長(zhǎng)度的且是親水的分子鏈，即所謂的“柔性鏈”，接有柔性鏈的柔性載體的引入，在制備固定化酶的過程中，當(dāng)酶與柔性載體相碰撞結(jié)合時(shí)，就會(huì)因柔性鏈的緩沖作用，使酶保持構(gòu)象不變以減少酶的活力損失;另外，在柔性固定化酶與底物作用時(shí)，被固定到柔性載體上的酶可以更好地保留酶游離態(tài)的均相催化活性，還能使酶蛋白構(gòu)象因受微環(huán)境的改變而發(fā)生折疊、失活處于亞穩(wěn)態(tài)時(shí)，當(dāng)施加反折疊措施，酶恢復(fù)正常構(gòu)態(tài)時(shí)，因柔性而位壘更低，更易于恢復(fù)，即可增加酶的自恢復(fù)能力，從而解決酶蛋白的不穩(wěn)定性問題[2-6]。

脂肪酶在有機(jī)溶劑中具有高的催化活性和立體選擇性，因而已廣泛應(yīng)用于制備具有光學(xué)活性的醇、脂肪酸及其酯等純手性醫(yī)藥和農(nóng)藥的中間體[7]。

本文通過研究實(shí)現(xiàn)制備Chitosan-GA載體，固定化商品脂肪酶并優(yōu)化固定條件;Chitosan-GA載體固定化實(shí)驗(yàn)室自產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶并優(yōu)化固定條件。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器與試劑

細(xì)胞破碎儀，Biosafer 250-88，賽飛（中國(guó)）有限公司;恒溫振蕩器，THZ-82，北京國(guó)華儀器;真空干燥器，2K-82A，上海試驗(yàn)儀器總廠;磁力加熱攪拌器，79-1，常州國(guó)華電器有限公司。

殼聚糖，濟(jì)南海得貝，冰醋酸、六偏磷酸鈉、聚乙烯醇、正庚醇、環(huán)己烷、無水乙醇、丙酮、戊二醛均為國(guó)產(chǎn)分析純。Candida rugosa脂肪酶：酶的穩(wěn)定溫度2～8 ℃，最佳反應(yīng)溫度為37 ℃，適于水解橄欖油等短鏈底物。

1.2 ?固定化材料

1.2.1 ?Chitosan-GA載體（Chi-GA）的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[8]制備Chitosan（Chi）小球：將殼聚糖 5 g溶解于200 mL 8%的醋酸得到2.5%的殼聚糖的醋酸溶液，并加入20 mL氫氧化鈉溶液（0.5 g·mL-1），將所得殼聚糖的醋酸溶液調(diào)至pH=6。注入1.5%的六偏磷酸鈉溶液中，使殼聚糖液固化成小球，置換新鮮的六偏磷酸鈉溶液浸泡一夜。取少量載體，經(jīng)水洗，醇洗后水泵干燥，再真空干燥過夜。

Chi-GA載體制備：取上述Chitosan小球3 g，加入到1 mL戊二醛（GA，25%）水溶液及15 mL乙醇（50%）水溶液中，70 ℃下反應(yīng)24 h后，用熱、冷水洗5遍，洗去過量的GA，置于磷酸緩沖液（pH=7，0.05 g·mL-1）中浸泡備用。

1.2.2 ?固定化酶Chi-GA-CRL的制備

通過改進(jìn)文獻(xiàn)[2，4，8]的方法，在錐形瓶中加入一定量固定化載體，加入一定量酶液和緩沖液，在一定溫度下恒溫振蕩一定時(shí)間。固定化結(jié)束后，過濾，用蒸餾水洗滌至載體表面無殘留游離酶，再用磷酸緩沖液洗滌，抽濾后測(cè)固定化酶活力[9-11]。

1.3 ?酶活力測(cè)定

1.3.1 ?試劑配制???緩沖液：0.05 g·mL-1磷酸緩沖液，pH=7;? 底物溶液：4%聚乙烯醇（PVA）溶液與橄欖油以體積比3：1混合，用細(xì)胞破碎儀超聲30 min充分乳化均勻;終止液：乙醇和丙酮混和溶液（V：V=1：1）;脂肪酶液：用緩沖液充分溶解脂肪酶粉（50 mg/mL）;上清液：固定化后的酶液上清液。