四川主產煙區烤煙主流煙氣特征成分分析

曾淑華，任 亞，劉少軍，郭仕平，劉 雷，信俊峰，劉雅潔*

1. 四川農業大學農學院，成都市溫江區惠民路211 號 611130

2. 四川省煙草專賣局，成都市高新區世紀城路936 號 610041

煙葉的香氣品質是決定煙葉可用性以及煙葉產區發展的基礎，相關研究備受重視。各種植區域的生態環境、煙葉感官質量、化學成分及代謝物均存在差異，研究表明生態因素對烤煙品質和風格特色起決定性作用[1-5]。不同生態條件下烤煙主要化學成分和致香物質質量分數差異明顯[6-8]。煙葉內在化學成分是煙葉品質和風格特征的物質基礎，煙葉的香型分布有明顯的地域性特點[9]。四川省是我國烤煙主產區之一，省內煙區間生態條件差異明顯，煙葉香型風格也有不同。

煙氣是煙葉燃燒并發生復雜熱化學反應后的產物，而主流煙氣是直接進入卷煙消費者口腔的物質，煙氣化學成分組成及其釋放量對卷煙感官質量及香型風格有直接影響。因此，分析主流煙氣成分對于認識煙葉香型特點具有重要意義。已有較多的研究者從煙葉化學成分方面分析四川烤煙的特色[10-11]，而與特色相關的烤煙煙氣成分的分析工作尚顯不足。因此，本研究中對四川省不同煙區單料烤煙的主流煙氣成分進行GC/MS、PCA 和OPLS-DA 分析，旨在明確各種植區煙葉產品的煙氣特征，為四川省煙葉特色彰顯與分類提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

35 個烤煙樣品取自四川省涼山州、攀枝花市、瀘州市、宜賓市、廣元市，等級為C3F，每個樣品5 kg。煙葉的詳細信息見表1。

二氯甲烷、無水硫酸鈉（AR，成都市科隆化學品公司）；乙酸苯乙酯（內標，AR，上海甄準生物科技有限公司）。

表1 煙葉取樣信息Tab.1 Information on tobacco leaf samples

GC-MS2010 氣質聯用儀（日本Simadzu 公司）；JJ124BC 電子天平（感量0.000 1 g，常熟雙杰測試儀器廠）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；進樣瓶（海門市敏磊玻璃儀器廠）；0.45 μm有機相濾膜（江蘇綠盟科學儀器有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；SB25-12DTDN 超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙支樣品卷制

將表1中烤煙樣品分別切絲、卷制成直徑為8 mm、長度為（60+24）mm、質量為0.9 g 左右的煙支，每個樣品卷制50 支卷煙。

1.2.2 煙支樣品燃吸將煙支置于溫度（22±1）℃，相對濕度（60±2）%環境條件下平衡48 h。挑選5 支質量范圍為平均值±0.15 g 的煙支進行燃吸。利用卷煙主流煙氣捕集裝置進行煙支抽吸和煙氣捕集：每次抽吸持續時間3 s，每次抽吸煙氣量為35 mL，頻率為1 次/60 s[12]。

1.2.3 煙氣捕集與GC/MS 定性和定量分析

利用盛裝CH2Cl2的溶劑捕集器進行煙氣捕集并萃取。加入內標乙酸苯乙酯，即為GC/MS 分析樣品液。GC/MS 條件：

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）毛細管柱；進樣口溫度：250 ℃；載氣：He，1 mL/min；進樣量：3 μL，不分流；升溫程序：50 ℃（2 min）150 ℃（2 min）240 ℃（5 min）；接口溫度：250 ℃；電離方式：EI；離子源溫度：200 ℃；電離能量：70 eV；掃描范圍：30～400 amu。

煙氣成分總離子流圖（TIC）采用島津GC/MS 工作站GC/MS Postrun Analysis 軟件進行數據分析。檢索NIST05/NIST05s 譜庫進行定性，選擇匹配度≥79%的成分，采用峰面積歸一化相對定量法進行定量。

1.2.4 數據分析

采用Excel 進行數據整理，采用SIMCA 13.0 進行數據主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），分析前對原始數據進行Log 轉換和UV縮放；采用SPSS 19.0 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 主流煙氣化學成分分析

35 個烤煙樣品單料煙支的主流煙氣經GC/MS 分析后，共鑒定出68 種釋放量較大的化學成分，其累計峰面積約占總TIC 圖峰面積的65%～85%，包括酮類9 種、醇類6 種、醛類3 種、酯類8 種、酚類8 種、烷烴類19 種、含氧雜環化合物6 種、含氮雜環化合物6種、有機酸3 種，詳見表2。

表2 主流煙氣化學成分定性檢測結果Tab.2 Qualitative results of chemical components in mainstream cigarette smoke

表2（續）

對不同種植區烤煙主流煙氣化學成分的歸類分析結果見表3。川西南種植區的醇類和含氮化合物顯著高于其他2 個種植區，川北種植區烤煙主流煙氣中酮類化合物的釋放量最高，3 個種植區的含氧化合物無明顯差異。

2.2 煙氣成分PCA 分析

對35 個煙葉樣品主流煙氣成分進行PCA 分析，結果見圖1。可知，川西南的涼山州和攀枝花市的煙葉樣品主要聚集在第1、第4 象限；而川南的瀘州市、宜賓市和川北廣元市的樣品，主要分布在第2、第3象限。說明不同產地煙葉主流煙氣成分存在明顯的差異。云煙87 和紅花大金元無分離趨勢，說明產地對烤煙煙氣成分的影響大于品種。

2.3 烤煙煙氣成分OPLS-DA 分析

2.3.1 不同產地烤煙煙氣成分的OPLS-DA 分析為了進一步認識不同種植區煙葉的煙氣成分差異，采用有監督模式的OPLS-DA 進行分析，得分圖見圖2，統計結果見表4～表6。由圖2 可知，涼山州和攀枝花市（川西南，SW）的樣品彼此聚攏，瀘州市和宜賓市（川南，SS）的樣品聚集在一起，而廣元市（川北，SN）的樣品聚集在一起。不同種植區的煙樣明顯分離，第一主成分將川北同川西南和川南樣品分開，第二主成分將川南和川西南樣品分開。樣品的識別正確率為100%（表5），采用交叉驗證方差分析（Cross-validated variance analysis, CV-ANOVA）檢驗了分析的可靠性，F=12.08，P值遠小于0.05（表6），表明OPLS-DA 分析統計上顯著有效。

表3 不同種植區烤煙主流煙氣化學成分比較分析①Tab.3 Chemical components in mainstream smoke of tobacco from different planting areas (%)

圖1 PCA 第1、2 主成分得分圖Fig.1 Score plot of 1st versus 2nd components in PCA

圖2 不同種植區烤煙OPLS-DA 第1、第2 主成分得分圖Fig.2 Score plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA of flue-cured tobacco from different planting areas

表4 不同種植區烤煙OPLS-DA 統計結果Tab.4 OPLS-DA statistics results of flue-cured tobacco from different planting areas

表5 不同種植區烤煙OPLS-DA 數據識別率Tab.5 Identification rate of OPLS-DA data of flue-cured tobacco from different planting areas

表6 不同產地烤煙OPLS-DA 交叉驗證方差分析結果Tab.6 Results of OPLS-DA cross-validated variance analysis of flue-cured tobacco from different planting areas

2.3.2 不同品種烤煙煙氣成分的OPLS-DA 分析

對品種間煙氣成分開展了OPLS-DA 分析，結果表明云煙87和紅花大金元彼此分離（圖3），統計結果中Q2僅為0.229（表7），小于0.5，說明其對變量的預測度太低。采用CV-ANOVA 檢驗了分析的可靠性，P 值為0.25（表8），大于0.05，表明OPLS-DA 分析統計上無效。分析結果表明品種間的差異較小。

圖3 不同品種烤煙OPLS-DA 第1、第2 主成分得分圖Fig.3 Score plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA of flue-cured tobacco of different varieties

2.3.3 不同種植區烤煙特征煙氣成分篩選

OPLS-DA的載荷圖和VIP（Variable importance for the projection）值見圖4 和圖5。由圖5 可篩選出VIP值大于1.35 的9 種煙氣成分；結合圖4 和5 可知，3 號（2-戊酮）、12 號（1-氯代十一烷）、20 號（2-乙酰基呋喃）、32號（2-甲基-1-苯基丙烯）、28號（5-甲基-3-己烯-2-酮）和15 號（苯乙烯）煙氣成分同川南種植區相關性高，47 號（乙酸松油酯）煙氣成分同川西南種植區相關性高，35 號（1-甲基環辛烯）和11 號（糠醛）煙氣成分同川北種植區相關性高。煙氣成分的方差分析（表9）結果表明，川南烤煙煙氣中3 號、12號、20 號、28 號和32 號煙氣成分的釋放量顯著高于川西南和川北，可作為川南種植區烤煙的特征煙氣成分；川西南烤煙煙氣中47 號煙氣成分的釋放量顯著高于川南和川北，可作為川西南種植區烤煙的特征煙氣成分；川北烤煙煙氣中35 號煙氣成分的釋放量顯著高于川西南和川南，可作為川北種植區烤煙的特征煙氣成分。

表7 不同品種烤煙OPLS-DA 統計結果Tab.7 OPLS-DA statistic results of flue-cured tobacco of different varieties

表8 不同品種烤煙OPLS-DA 交叉驗證方差分析結果Tab.8 Results of OPLS-DA cross-validated variance analysis of flue-cured tobacco of different varieties

圖4 OPLS-DA 第1、第2 主成分載荷圖Fig.4 Lording scatter plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA

圖5 OPLS-DA 的VIP 值Fig.5 VIP values of OPLS-DA

表9 VIP 值大于1.35 的煙氣成分比較分析①Tab.9 Variance analysis of mainstream smoke components with VIP values over 1.35

3 討論

四川省單料烤煙主流煙氣經GC/MS 法共檢測出68 種主要化學成分，包括酮類、醇類、醛類、酯類、酚類、烷烴類、含氧化合物、含氮化合物和有機酸共9類，與孫玉利等[13]鑒定出134 種、蔡君蘭等[14]鑒定出87種、韓冰等[15]鑒定出93種化合物有一定差異，可能與提取方法和GC/MS條件不同有關。在相同條件下，烤煙燃燒產生的煙氣成分主要是由遺傳因素、生態環境和栽培技術共同作用而決定的[16]。LIU Lei等[10]和王俊等[11]曾基于煙葉化學成分的差異研究了產地與煙葉特征的關系，并依此將四川省煙葉產區類型進行了劃分。本研究中基于對烤煙主流煙氣化學成分的PCA 和OPLS-DA 分析，發現川西南（涼山州和攀枝花市）、川南（瀘州市和宜賓市）和川北（廣元市）種植區烤煙主流煙氣成分存在明顯差異，說明不同煙區的生態條件會影響烤煙煙氣成分的構成，從而影響煙葉的品質和風格特征；而對品種間進行OPLS-DA分析發現，云煙87和紅花大金元間主流煙氣成分的差異較小，與生態決定特色[17]的研究結果一致。

研究還發現不同生態區域的特征煙氣成分差異明顯，川西南種植區烤煙的特征煙氣成分為乙酸松油酯，是香檸檬油的主要成分之一，具有愉快、涼爽和芳香的香氣[18]；川南種植區烤煙的特征煙氣成分為2-戊酮、1-氯代十一烷、2-乙酰基呋喃、2-甲基-1-苯基丙烯、5-甲基-3-己烯-2-酮和苯乙烯，2-戊酮帶有甜、果香，2-乙酰基呋喃為呋喃類香料，香勢強，特征性明顯，具有咖啡香、水果香和谷物香[17]；川北種植區烤煙的特征煙氣成分為1-甲基環辛烯。本研究中僅分析了各種植區的特征煙氣成分，而這些特征煙氣成分對烤煙香型的影響和作用還有待進一步研究。

4 結論

①利用自制煙氣捕集裝置與GC/MS 技術結合，在匹配度≥79%時，檢測出四川省烤煙單料煙支主流煙氣68 種主要化學成分；②經主成分（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），表明不同種植區烤煙主流煙氣成分存在明顯差異，而品種間主流煙氣成分的差異較小；③不同種植區烤煙的特征煙氣成分差異明顯。