應用聚合酶鏈式反應和限制性內切酶酶切技術鑒別鱈魚

樓葉青 胡藝凡 鄭方媛 袁望 陳麗鑫 宋婉如 李素芳 潘家榮

摘 要：大西洋鱈魚（Gadus morhua）作為一種具有高營養價值的海洋經濟魚類，常常會被摻入劣質、價格低廉的阿拉斯加狹鱈魚（Theragra chalcogramma）或白姑魚（Argyrosomus argentatus）等。通過對大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚和白姑魚的線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因序列進行比對分析，分別設計特異性引物。結果表明：通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增得到大西洋鱈魚和阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因擴增產物大小為579 bp，白姑魚為399 bp;進一步使用BstE Ⅱ限制性內切酶對大西洋鱈魚和阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因的PCR產物進行酶切，大西洋鱈魚不能被酶切，而阿拉斯加狹鱈魚被酶切為長度分別為361、218 bp的2 個片段，從而有效區分大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚和白姑魚。

關鍵詞：鱈魚;細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因序列;聚合酶鏈式反應;BstE Ⅱ酶切;鑒別

Abstract： Gadus morhua， an economically important marine fish with high nutritive value， is often adulterated with some inferior and cheap fish species such as Theragra chalcogramma or Argyrosomus argentatus. By comparative analysis of the sequence of mitochondrial gene （COⅠ） encoding cytochrome c oxidase subunit Ⅰ between Gadus morhua， Theragra chalcogramma and Argyrosomus argentatus， specific primers were designed separately for each fish species. The polymerase chain reaction （PCR） amplicons of COⅠ gene from Gadus morhua and Theragra chalcogramma were both 579 bp in length， while the amplified product of COⅠ gene from Argyrosomus argentatus was 399 bp in length. The PCR product of COⅠ gene from Gadus morhua could not be digested by the BstEII restriction endonuclease， while the PCR product of COⅠ gene from Theragra chalcogramma was digested into two fragments （361 and 218 bp）. As a result， Gadus morhua， Theragra chalcogramma and Argyrosomus argentatus could be effectively differentiated from one another.

Keywords： cod; cytochrome c oxidase subunit Ⅰ sequence; polymerase chain reaction; BstE Ⅱ digestion; identification

鱈魚隸屬脊椎動物門（Vertebrata）、真骨魚綱（Division Teleostei）、鱈形目（Gadiformes），是生活在海洋底層和深海中下層的冷水魚類[1]。鱈魚是經濟價值極高的海洋魚類，具有高蛋白、低脂肪、富含多不飽和脂肪酸、牛磺酸及多種維生素的特點，品質優于其他深海魚類[2-3]。鱈魚屬包括大西洋鱈魚（Gadus morhua）、格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）和太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）3 種。阿拉斯加狹鱈魚（Theragra chalcogramma）屬于狹鱈屬，與鱈魚屬親緣關系較近，在SN/T 3589.7—2013《出口食品中常見魚類及其制品的鑒偽方法 第7部分：鱈魚成分檢測實時熒光PCR法》[4]中將其歸為鱈魚類，但阿拉斯加狹鱈魚的市售價格遠低于大西洋鱈魚。白姑魚（Argyrosomus argentatus）為鱸形目（Perciformes）魚類，經加工處理后外觀與大西洋鱈魚難以區分。由于生態環境變化和過度捕撈，大西洋鱈魚在市場上較為稀缺[5]，而阿拉斯加狹鱈魚和白姑魚年產量相對較高，價格低廉。在商業利益驅動下，錯誤標簽、摻假銷售等現象時有發生[6-7]，以廉價的阿拉斯加狹鱈魚或白姑魚替換大西洋鱈魚，不僅嚴重損害消費者利益，而且增加了食品安全風險。

鱈魚物種傳統的鑒定方法是通過觀察生物形態、研究遺傳特點等鑒定物種類別[8]。而商品鱈魚通常經過去頭、冷凍切片等加工后進行銷售，鱈魚形態學特征缺失，外形鑒定方法難以達到對鱈魚或鱈魚加工產品真假或摻假鑒別的要求。基于核酸分子對物種進行鑒定的方法打破了傳統鑒定方法的局限性[9]，DNA序列不隨物種加工過程發生變化，在水產品及其加工產品物種鑒定中得到廣泛應用。采用環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[10-11]、DNA條形碼[12-14]、多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[15-16]、微衛星標記[16]等技術可以鑒定鮭科魚[10]、海參[13]、鱉[14]、鱒魚[15]、鳙魚[16]等物種。

自Hebert等[17]應用線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因進行物種鑒定以來，DNA鑒定技術在食品摻假、物種鑒定方面起到重要作用。畢瀟瀟等[18]針對太平洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚、遠東寬突鱈和藍鱈的COⅠ基因片段進行PCR擴增，得到長度均為601 bp的產物;萬超[19]、孫曉飛[20]等均針對COⅠ基因設計特異性引物，建立太平洋鱈魚和大西洋鱈魚的SYBR Green熒光PCR檢測方法;Fernandes等[21]通過對COⅠ基因區域的分析，開發了一種能夠更快速、有效分辨4 種鱈魚的實時定量PCR檢測方法。

限制性內切酶與PCR相結合的技術常用于區分親緣關系較近的物種，陳雙雅等[22]擴增細胞色素b（cytochrome b，Cyt b）基因464 bp片段，并對PCR產物采用Dde Ⅰ、Hae Ⅲ、Nla Ⅲ限制性內切酶進行酶切，建立橫紋東方鲀、黃鰭東方鲀、菲律賓叉鼻鲀、懷氏兔頭鲀及月兔頭鲀5 種河豚的物種鑒定方法;Sumathi等[23]將16S rRNA基因的PCR產物采用Sdu Ⅰ、Bci Ⅵ、Sau3 AⅠ限制性內切酶進行酶切，鑒別5 個石斑魚品種。

目前，國內外對鱈形目魚類DNA特異性的研究較少，為了更加有效確保鱈魚產品質量，建立一種實用性強、準確性高的鱈魚DNA特異性檢測方法是必要的。本研究選取鱈魚線粒體COⅠ基因作為鑒定片段進行比對分析，大西洋鱈魚和阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因序列匹配度高達96.91%，設計鱈魚種間特異性引物PCR難以直接鑒別大西洋鱈魚和阿拉斯加狹鱈魚，需在此基礎上結合限制性內切酶酶切技術對鱈魚進行進一步物種鑒定。旨在考察利用COⅠ基因鑒別鱈魚的可行性，以建立一種有效、快速鑒別真假鱈魚的方法，為鱈魚及其產品物種防偽及保護的分子鑒定進行有益探索，為海產品貿易的商業打假提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚（原產于冰島）、白姑魚（臺州海域捕撈的野生白姑魚）購于市場專營店。冷凍魚肉樣品置于-20 ℃冰箱貯藏備用。

DNA提取所需混合裂解液（含STE緩沖液（pH 8.0，由10 mmol/L三羥甲基氨基甲鹽酸（Tris-HCl）（pH 8.0）、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 8.0）組成）和20 g/100 mL十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS），其中STE緩沖液、SDS溶液體積比為25∶1）、酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V） 杭州諾揚生物技術有限公司;脫氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）溶液（10 mmol/L）、Taq DNA聚合酶、ddH2O、MgCl2、瓊脂糖、蛋白酶K（12 mg/mL）、無水乙醇、BstE Ⅱ限制性內切酶（B300155-0001）、1×TE（Tris-EDTA）緩沖溶液 生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

T960 PCR儀 杭州晶格儀器有限公司;核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司;Tanon-3500 10T5553-825凝膠成像系統 上海天能科技有限公司;ND2000微量核酸蛋白分析儀、PICO 17臺式離心機 美國Thermo公司;HH系列數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市科析儀器有限公司;XH-C漩渦混合器 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

在參考酚-氯仿抽提法提取DNA[24-25]的基礎上，優化反應體系、合并試劑并簡化步驟[26]，按下列方法提取DNA。

稱取約100 mg魚肉，粉碎后裝于2 mL離心管中，加入550 μL混合裂解液和15 μL蛋白酶K（12 mg/mL），漩渦振蕩數秒，置于56 ℃水浴鍋水浴30 min;取上層清液于新管中，加入500 μL酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），漩渦振蕩數秒，10 000 r/min離心4 min;吸取上清液于新管中，加入500 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），漩渦振蕩數秒，10 000 r/min離心3 min;吸取上清液于新管中，加入50 μL氯化鈉溶液（5 mol/L）和1 000 μL無水乙醇，漩渦振蕩數秒，10 000 r/min離心3 min;棄去液體，加入600 μL體積分數75%乙醇，漩渦振蕩數秒，10 000 r/min離心3 min;棄去液體，開蓋將離心管反扣在吸水紙上靜置數分鐘;加入100 μL 1×TE緩沖液，靜置片刻使DNA溶解;使用ND-2000微量核酸蛋白分析儀測定提取的DNA濃度與純度，記錄并標記后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 PCR引物設計

從NCBI數據庫下載多個大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚、白姑魚的DNA線粒體基因全序列，利用DNAman軟件進行比對分析，從中選擇COⅠ基因用于后續引物設計。以大西洋鱈魚（X99772）、阿拉斯加狹鱈魚（AB182300）、白姑魚（HQ890946）的COⅠ基因序列進行比對。依據物種間的特異性區段，使用DNAman軟件設計得到多組引物，結合特異性引物的基本要求和實驗可行性篩選并經人工矯正得到的最終特異性引物如表1所示，大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚擴增產物序列理論長度為579 bp，白姑魚擴增產物序列理論長度為399 bp。

50 μL PCR擴增體系組成如表2所示。PCR管中體系10 000 r/min離心1 min，使體系沉降，減少氣泡，有利于擴增。PCR儀循環程序設置為：95 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。收集擴增產物進行電泳凝膠檢測和酶切備用。

1.3.3 限制性內切酶酶切

PCR產物用BstE Ⅱ限制性內切酶進行酶切，30 μL酶切體系組成：10 μL PCR產物、16 μL ddH2O、2 μL Buffer、2 μL BstE Ⅱ限制性內切酶原液（10 U/μL）。酶切條件：37 ℃酶切處理1 h，酶切產物65 ℃滅活30 min后進行凝膠電泳檢測。

1.3.4 PCR產物測序與比對

取PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結果與GenBank核酸數據庫選擇設計出的COⅠ基因序列進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 不同魚肉樣品COⅠ基因序列的PCR擴增結果及分析

1. 大西洋鱈魚;2. 阿拉斯加狹鱈魚;3. 白姑魚;M. DNA Marker C（100～1 200 bp）。

由圖1可知，大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚與白姑魚COⅠ基因序列的PCR擴增產物長度與理論大致相符，經測序得到的結果和實驗設計預期結果一致。因此可以依據COⅠ基因序列的PCR產物條帶有效區別鱈魚的優劣及其摻假物種白姑魚。

2.2 不同魚肉樣品COⅠ基因序列PCR擴增產物的酶切

箭頭表示酶切位點;橫向黑色方框表示引物序列位置;序列上方數字表示基因序列長度。

為了進一步鑒別阿拉斯加狹鱈魚和大西洋鱈魚，在阿拉斯加峽鱈魚COⅠ基因序列的PCR擴增產物片段中尋找BstE Ⅱ限制性內切酶（5-G/GTNACC-3）酶切位點，通過酶切分析對產物進行進一步區分。由圖2可知，阿拉斯加峽鱈魚COⅠ基因在676～682 bp位置的序列與酶切位點一致，可以被酶切為361 bp和214 bp 2 個片段，而大西洋鱈魚在681 bp位點上的堿基為T，與BstE Ⅱ識別的靶序列不同，不能被酶切。

M. DNA Marker C（100～1 200 bp）;1. 阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因序列PCR產物酶切片段;2. 阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因序列PCR產物;3. 大西洋鱈魚COⅠ基因序列PCR產物酶切片段;4. 大西洋鱈魚COⅠ基因序列PCR產物。

由圖3可知：大西洋鱈魚COⅠ基因序列PCR擴增產物無酶切位點，酶切處理后產物的條帶長度仍約為579 bp;阿拉斯加狹鱈魚COⅠ基因序列PCR擴增產物經過酶切處理后，產物包括長度約為361、218 bp的2 個片段，說明在PCR基礎上運用酶切技術能夠區別大西洋鱈魚及阿拉斯加狹鱈魚。

3 討 論

中國的食品標簽受到眾多法律、法規和標準的制約。依據強制性國家標準GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》，產品名稱和成分表是預包裝產品魚類信息的主要來源。國家質量監督檢驗檢疫總局關于修改《食品標識管理規定》的決定（總局2009年第123號令）[27]

涉及國內生產（分裝）食品的標識標注和管理。2015年10月1日生效的《中國食品安全法》修訂版進一步嚴苛了食品安全監管，然而大多數海鮮標簽和可追溯性的具體標準都是非強制性標準，仍然缺乏關于漁業產品標簽的具體規定和海產品貿易名稱的正式參考清單[28]。在中國市場上新推出的海洋漁業產品中，鱈魚是最受歡迎的產品之一，鱈魚的摻偽問題也廣泛引起關注，如含有蠟油質的油魚（Pseudogyrincheilus procheilus）、低價的阿拉斯加狹鱈魚、白姑魚或其他與鱈魚種屬相關但來歷不明的物種但因標記不明晰進入市場，對鱈魚或其加工制品進行摻偽的行為在世界各國均已有報道[29-30]，這些行為增加了鱈魚及其制品含有過敏源或有毒有害物質的風險。

在食品貿易全球化時代，海產品通常經過復雜的物流網到達銷售地，難以追溯原產地，依據加工海產品的殘留特征也難以進行形態鑒定[28]。為了支持海產品標準文件的可追溯性，已經提出許多基于DNA的鑒定方法。例如，基于680 bp COⅠ基因區域的DNA條形碼技術[31]是最常用的方法之一[17-21，32-34]。COⅠ基因較容易被通用引物擴增，能夠獲得絕大多數動物的5端序列，具有穩健性[35-36]。其次，COⅠ基因相較于其他線粒體基因具有更大范圍的系統發育信號[31]。COⅠ基因相較于編碼核糖體（12S、16S）DNA的線粒體基因不易出現插入和缺失[31]，并且與其他蛋白質編碼基因一樣，其第3位核苷酸顯示出高堿基取代發生率，導致分子進化速率加快，這種進化速率優勢使其不僅可以用于區分密切相關的物種，還可以用于區分單一物種內的系統地理群[37-38]。不同品種鱈魚與其易混淆魚類COⅠ基因序列的相似度在78.1%～80.6%之間[6]。王敏等[39]以COⅠ基因為目標基因，應用DNA條形碼技術鑒別77 份深圳批發市場和超市零售魚肉制品的來源，結果表明，產品“錯貼”率高達36.36%。Cawthom等[40]利用DNA條形碼技術研究南非市場的魚類，發現在批發商和零售商中貼錯標簽的比例差別巨大。雖然通過DNA條形碼技術可以對魚的種類進行鑒定，但是檢測用引物是通用引物，對于市場上的部分加工制品，對混合DNA進行鑒定需要將多個PCR產物純化后與載體連接，轉化培養后挑選單克隆菌落，再經過測序達到鑒定目的，過程繁瑣且存在極大的漏檢可能性[41]。本研究設計2 組PCR引物鑒別白姑魚，結合內切酶方法，能夠直接根據電泳圖上條帶長度的差異判定PCR產物能否被限制性酶切，達到鑒別鱈魚的目的，即使對混合DNA的復雜樣品也能實現成分的有效鑒定。

SN/T 3589.7—2013詳述了利用實時熒光PCR法對出口食品中鱈魚成分進行檢測的方法，可以用于太平洋鱈魚、大西洋鱈魚、黑線鱈、青綠鱈、藍鱈、青鱈、狹鱈、南非無須鱈、阿根廷無須鱈及北太平洋無須鱈等鱈魚及其制品的定性檢測。現有鱈魚標準檢測方法不能夠覆蓋整個鱈形目[41]，且所述方法的PCR產物片段較短，長度大約為80 bp，實驗過程需嚴格要求無DNA酶污染，并防止反應產物的交叉污染。目前，魚肉制品的鑒定技術主要還包括近紅外光譜技術、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）標記（微衛星標記）技術、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術等[42-43]。近紅外光譜技術能夠較為快速地鑒別魚肉制品，然而需要應用建模工具，在應用方面具有局限性[6];SSR標記技術在雜合子和純合子方面具有優勢，但SSR標記的等位基因數目較多，在DNA指紋識別上具有難度[42-43];操作簡便的AFLP技術的譜帶錯配率和高成本是其限制性因素[43]。Dooley等[44]

應用PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和基因芯片技術，基于Cyt b基因對鑒定10 種不同英國鱈魚產品，利用Dde Ⅰ限制酶區分了8 個魚種，當與Nla Ⅲ和Hae Ⅲ 2 種酶組合時，產生了所有10 個魚種的特定譜，說明PCR與RFLP技術聯用在魚種鑒定方面具有有效性。本研究在對樣品進行魚種鑒定時，應用PCR結合限制性內切酶對特定片段的特定位點進行識別切割，通過電泳圖的條帶大小進行鑒定，大部分鑒定結果均與目的結果相吻合，說明本研究中的方法對于初步鑒別大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚和白姑魚具有實際意義，無需復雜昂貴的檢測儀器，是海產品物種防偽及保護分子鑒定方面的有益探索。在穩定本研究結果和靈敏度的基礎上，未來可探求PCR技術與基因芯片技術、時間溫度梯度電泳等相結合的聯用技術，以期實現對成分單一或復雜的鱈魚肉制品的更準確、快速鑒別[45-46]。

4 結 論

結合PCR擴增技術和限制性內切酶酶切技術設計了一種可以有效鑒別大西洋鱈魚、阿拉斯加狹鱈魚和白姑魚的方法，通過對待測魚種進行DNA提取，對其進行PCR擴增實驗，實現了大西洋鱈魚和阿拉斯加狹鱈魚2 種鱈魚與白姑魚的鑒別;在此基礎上運用限制性內切酶技術，結果表明，阿拉斯加狹鱈魚PCR產物被酶切成長度約為361 bp和218 bp的兩部分，從而可以有效將其與大西洋鱈魚進行區分。該方法特異性高、簡便實用、檢測時間短，可滿足市場監管和檢驗的適用性要求，具有較大的推廣價值和應用前景，對維持鱈魚市場健康發展及維護廣大消費者利益具有重要意義。

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