基于環介導等溫擴增技術的生物傳感器研究進展

林晟豪,杜再慧,張秀杰,黃昆侖,3,劉清亮,許文濤,3*

1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083；2.農業農村部科技發展中心,北京 100122；3.中國農業大學,農業農村部農業轉基因生物安全評價(食用)重點實驗室,北京 100083；4.山東拜爾檢測股份有限公司,山東 濰坊 261061

目前，核酸擴增技術在分子生物學研究領域中發揮著重要作用，具體可分為變溫擴增技術和等溫擴增技術。變溫擴增技術主要為PCR；等溫擴增技術則包括滾環擴增(rolling cycling amplification，RCA)、指數擴增反應(exponential amplification reaction，EXPAR)、鏈置換擴增(strand displacement amplification，SDA)、依賴解旋酶等溫擴增(helicase-dependent isothermal amplification，HDA)以及環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。變溫擴增技術對設備依賴性強，因此適用場合受到了一定的限制；而與之相比，等溫擴增技術只需在恒定溫度下即可完成，易于實現原位和實時檢測。

等溫擴增技術中的HDA技術易受DNA解旋酶和靶DNA長度的影響，SDA技術和EXPAR技術受到限制性核酸內切酶的限制，均難以在基因工程中推廣；RCA技術則因需要昂貴的鎖式探針而受到限制，并且存在信號檢測背景。而于2000年被日本榮研化學株式會的Notomi等[1]發現的LAMP技術，通過設計4～6種特異性引物識別靶標DNA的6～8個區域，在65 ℃左右的恒溫條件下由DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)聚合延伸，從而可實現靶標DNA的109～1010倍擴增。相較于HDA、SDA、EXPAR和RCA等其他等溫擴增技術，LAMP沒有被上述因素所局限，是目前研究最多、最成熟的一種等溫擴增技術，具有簡單、快速、特異性強等優點[2]。生物傳感器是以生物學組件作為主要功能性元件，能夠感受規定的被測量物質并按照一定規律將其轉換成可識別信號的器件或裝置。根據生物傳感器的輸出信號可分為比色生物傳感器、熒光生物傳感器、電化學生物傳感器以及其他種類的生物傳感器。目前，基于LAMP技術的生物傳感器各具特色，被廣泛開發利用?；诖耍疚膶AMP進行了基本介紹，然后，重點介紹了基于LAMP的各類生物傳感器，并對各類生物傳感器的特點進行了總結、比較。最后，剖析了LAMP生物傳感器目前的不足，并對其未來的發展方向做出展望，以期為今后研發低成本、高靈敏度、自動化、微型化的LAMP生物傳感器提供參考。

1 環介導等溫擴增技術

LAMP技術是一種等溫擴增技術，其反應體系主要由模板、4～6種特異性引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、甜菜堿(betaine)等組成。其中，特異性引物的設計是LAMP技術的關鍵，根據模板鏈的3′端的F3c區段、F2c區段、F1c區段和5′端的B3區段、B2區段、B1區段設計LAMP引物，具體位置如圖1所示。為了達到良好的擴增效果，引物設計還要遵循一定的設計原則[4]，具體為：F2的5′到B2的5′為120～180 bp，F3的3′到F2的5′為0～20 bp，F2的5′到F1的5′為40～60 bp；F1c/B1c的Tm值在64～66 ℃，F2/B2的Tm值在59～61 ℃，F3/B3的Tm值在59～61 ℃；F2/B2、F3/B3的3′端和F1c/B1c的5′端的脫氧鳥嘌呤核苷(deoxyguanosine，dG)小于-16.72 kJ/mol；GC含量的范圍為40%～65%。同時，還可通過日本榮巖株式會社環介導引物設計軟件Primer Explorer 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)來完成引物設計。此外，LAMP擴增體系中加入甜菜堿可以減少二級結構的形成，更利于LAMP反應的進行。

圖1 LAMP引物設計[3]Fig.1 Primer design of LAMP[3]

LAMP通常在65 ℃左右進行，主要是由于基因組在65 ℃左右處于動態平衡狀態，當DNA序列與引物配對后即可進行互補延伸，延伸的過程即可將基因組剝離得到另外一條單鏈[5-6]，進而完成LAMP循環擴增。與其他擴增方法相比，LAMP方法具有以下幾個優點。①擴增條件簡單，不需要進行雙鏈的變性，在恒定溫度下即可完成擴增[7]。②設計4～6條引物靶向6～8個區段，特異性較高[8]。③1 h內即可實現靶標DNA 109～1010倍的擴增，如果在LAMP反應中加環引物，反應速度還可提高1/2～1/3[4]。④靈敏度高，檢測限可達10個拷貝甚至更少[9]。⑤檢測信號多樣、簡單，如電泳分析、焦磷酸鎂濁度分析[10]、比色指示劑顏色變化、熒光信號輸出等。⑥在體系中加入逆轉錄酶，可實現RNA的LAMP擴增[11]。但LAMP同時還具有以下幾個缺點。①引物設計具有一定的難度，易導致非特異性擴增，造成假陽性[12-13]。②反應靈敏度高，當空氣中存在氣溶膠污染時極易造成污染[14-15]。③擴增產物復雜多樣，導致目標DNA片段難于分離，難以進行下一步的序列分析。④擴增長度需要控制在300 bp以內，大于500 bp則難以擴增。

2 LAMP比色生物傳感器

2.1 基于比色指示劑的LAMP生物傳感器

2.1.1金屬變色指示劑 常見的金屬變色指示劑有羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue，HNB)[16]和孔雀綠[17]，其中使用和研究最多的是HNB。HNB與Mg2+結合顯示紫羅蘭色；當LAMP反應時，Mg2+與焦磷酸根結合生成沉淀，HNB失去Mg2+轉變為天藍色，變色現象肉眼可見[18]。如以HNB作為指示劑，檢測到了30 CFU/mL的大腸桿菌[16]。

2.1.2金納米粒子 ①金納米球。在高鹽條件下，金納米球(gold nanoparticles，AuNPs)單獨存在時會發生鹽聚而顯示藍色，同時紫外(ultraviolet，UV)光譜從520 nm向更長波移動。在AuNPs上修飾具有靶DNA互補序列的寡合探針，當LAMP擴增后，LAMP擴增子與AuNPs探針互補雜交，從而阻止AuNPs聚集而顯紅色，該現象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測UV光譜在520 nm處是否發生紅移，從而實現定量檢測。利用該原理，Suebsing等[19]針對白斑綜合征蝦中微孢子蟲腸球菌核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因進行檢測，結果表明檢出限達到0.02 fg，靈敏度是普通PCR的10倍。

此外，在AuNPs表面修飾特定基團后，其可與焦磷酸鎂發生螯合，從而出現顯色或沉淀。如當11-巰基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid，MUA)修飾在AuNPs上時，MUA-AuNPs可以螯合Mg2+，其在低Mg2+下游離并顯示紅色，在高Mg2+下螯合Mg2+并顯示紫色[20]。在LAMP反應中Mg2+濃度逐漸降低，加入MUA-AuNPs后，溶液顏色會發生從紫色到紅色的變化。Wong等[20]使用該方法檢測λDNA的特定模板，得到了200個拷貝的檢測限。在加入MUA-AuNPs的同時，加入乙二醇(ethylene glycol，PEG)修飾的AuNPs，可以螯合Mg2+使AuNPs聚集顯示紅色。這是由于LAMP反應體系中會生成大量焦磷酸鎂，與MUA/PEG-AuNPs結合生成紅色沉淀，該現象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測UV光譜在520 nm處是否發生紅移，從而實現定量檢測，檢測限可以低至500個拷貝[21]。

②金納米棒。金納米棒(gold nanorods，GNRs)與AuNPs不同，GNRs因其細長形狀而具有一些獨特的表面電荷和光學性質。十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)可以組裝在GNRs表面，使GNRs表面帶有大量正電荷。在LAMP反應時，帶負電荷的靶DNA與修飾后的GNRs相互吸引，顏色從紅色轉為紫色，該現象可以直接通過肉眼觀察，或者使用紫外可見分光光度計(UV-vis)分析加入GNRs前后溶液在915 nm處的峰值是否下降以及在可見峰525 nm處的峰值是否紅移，從而實現定量分析。該方法可用于檢測人類流感病毒，靈敏度較高，檢測限低至1 pg[22]。

2.1.3G-四聯體 G-四聯體(G-quadruplex)是由4個環狀氫鍵和鳥嘌呤(G)組裝成的2個或者多個G-四分體形成的π堆積結構，該結構由于暴露了G-四分體的表面，所以可以結合眾多類似G-四分體的配體，如帶有卟啉結構的配體[23-24]。當LAMP擴增子中有富G序列時，在存在單價陽離子(如Na+或K+)的情況下可折疊成G-四聯體構型，該構型與插入的氯高鐵血紅素結合將具有特定的催化活性，可將無色的2,2′-聯氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS2-]氧化成綠色的ABTS-，該現象可以直接通過肉眼定性判別，或者借助吸收光譜進行定量分析[25]。Zhu等[26]利用該方法，在上游內引物(forward inner primer，FIP)上簡單修飾了17 nt富含C的寡核苷酸，檢測到了0.5 pg甚至更少的沙門氏菌invA基因。

2.1.4焦磷酸鎂 LAMP反應進行時，焦磷酸根離子會大量合成并與Mg2+結合產生肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀，而PCR法擴增產生的焦磷酸離子只有不到0.1 μmol/L。研究表明，通過肉眼觀察白色沉淀，可檢測到6×104CFU/mL的青枯雷爾氏菌[10]。而Mori等[27]進一步證明了靶DNA的擴增量與濁度變化具有線性關系，焦磷酸鎂沉淀在400 nm處的吸收光度與反應體系的濁度也存在相關性，所以根據400 nm處吸光度計算溶液濁度，再換算到靶DNA的擴增產物總量，即可定量分析LAMP反應的擴增效率。如Kouzaki等[28]使用濁度計檢測到了1.0 pg的?？ń槊鏜基因，遠高于肉眼檢測的靈敏度。

2.1.5氫氧化銅 在LAMP反應中，有待測基因組存在時，只會生成少量Mg2P2O7沉淀，而對照組(未加待測基因組)中dNTPs的含量不變，dNTPs解離出的OH-，可以與加入的CuSO4生成Cu(OH)2環狀白色沉淀，該沉淀比Mg2P2O7沉淀更易觀察[29]。Kanchanaphum等[29]通過該方法檢測人的載脂蛋白L1基因(ApoL1)，得到了10 pg的檢測限。

2.1.6pH指示劑 在最小緩沖條件下，LAMP反應產生的H+會顯著降低溶液pH，使用特定的pH指示劑檢測pH變化即可實現視覺上檢測靶DNA擴增與否。目前，已經開發的pH指示劑多用二甲酚橙(xylenol orange，XO)，其隨著pH的降低，顏色從紫色變成紅色/橙色。該方法成本低廉、操作簡單，并且不會抑制DNA聚合酶的活性[30]，但是理論上說pH降低2個單位以上才適合使用pH敏感指示劑[31]。研究表明，利用該方法檢測大腸桿菌時能夠檢測到1 CFU大腸桿菌[32]。

2.2 基于免疫吸附的LAMP生物傳感器

2.2.1酶聯免疫吸附 酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)主要有3種分類：直接ELASA、間接ELASA和夾心ELASA。使用ELISA測定時，待測物與固相載體表面的抗原/抗體發生反應，洗滌分離抗原/抗體復合體，再加入酶標記的抗原/抗體將其固定在固相載體上。由于產物的量和顏色深淺與原物質的量直接相關，因此可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。LAMP與ELISA結合起來的LAMP-ELISA法具有高度靈活性和高通量等優點，不需要昂貴的設備[33-34]，并且檢測靈敏度高，用于檢測犬細小病毒時，檢測限低至25個拷貝[35]。

2.2.2側向流層析試紙條 側向流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)依賴于試紙條上的抗原/抗體或配體相互作用，通過觀察紙條上的檢測線和質控線即可判斷靶DNA擴增與否。標記X2的探針與標記X1的擴增子雜交，并與標記X2抗體的膠體金結合形成三元復合物，通過橫向層析結合到標記X1抗體的檢測線上并呈現紅色；而未雜交的標記X2的探針與標記X2抗體的膠體金穿過檢測線后結合在質控線上。通過觀察條帶就可以判斷有無LAMP擴增產物產生。Pasookhush等[36]通過雙重LAMP(duplex LAMP，dLAMP)結合LFD檢測創傷弧菌和副溶血弧菌，其中創傷弧菌的檢測限達到2.2×104CFU/mL，與雙重PCR(duplex PCR，dPCR)的檢測靈敏度一致；而副溶血弧菌的檢測限達到2.2×103CFU/mL，比dPCR的靈敏度高100倍。

2.2.3免疫磁珠 磁珠(magnetic beads，MBs)可以在磁場下聚集，并在移除磁體的時候分散[37]。磁珠分離法具有處理簡單、快速、高效、減少產物損失和清潔等優點[38-41]。Roy等[42]在MB和LAMP引物上分別修飾鏈霉親和素、生物素，當LAMP反應時，生物素化的靶DNA與修飾鏈霉親和素的磁珠結合形成聚合物，在外磁場的作用下分離聚合物并移到紙上，可以通過肉眼觀察到紅色的斑點，同時，拍照后利用Image J軟件分析，定量檢測到了1 pg/μL的沙門氏菌。

2.3 其他LAMP比色生物傳感器

咖啡環效應在生活中較為常見，產生的原因如下：三相接觸線的較高蒸發速率引起毛細管流動，溶液被運輸到液體的周邊，當溶劑被蒸干之后，懸浮的焦磷酸鎂顆粒被集中固定在邊緣，形成環狀結構[43]。近年來，研究還發現咖啡環的寬度與LAMP反應前的DNA濃度呈對數線性關系，因此該方法還可以用于定量分析[44-45]。Zhang等[46]以SiO2納米粒子的膠體晶體材料為基質，利用咖啡環效應得到了肉眼可見的環狀物質，并結合智能手機檢測沙門氏菌反應體系，在5 min內得到了20個拷貝的檢測限。

此外，雖然紙張分析裝置的比色分析所需設備簡單，具有簡單快速、低成本等特點，可用于資源匱乏的地區，但是因為人為差異可能導致測量結果不穩定[47-48]。研究表明，HNB可以與Mg2+結合顯示紫色，并且當Mg2+濃度降低時，顏色從紫色變為天藍色[18]。因此，在紙張上固定可以與HNB結合的一種強陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺)，將LAMP反應產物轉移到紙張上，溶液因為毛細管效應在紙張上遷移，遷移過程中游離的HNB與聚乙烯亞胺結合并被固定在紙張上，使用洗滌劑洗脫HNB-Mg2+后紙張上將留下藍色條帶。LAMP擴增子的量與游離HNB存在一定關系，而游離HNB的量與藍色條帶的距離成比例，因而可以使用該方法半定量檢測LAMP反應[49]。Hongwarittorrn等[49]利用該方法檢測大腸桿菌的malB基因，在5 min內得到了4.14×103個拷貝的檢測限。

3 LAMP熒光生物傳感器

3.1 基于金屬變色指示劑的LAMP生物傳感器

常見的金屬變色指示劑為鈣黃綠素(calcein)[50]。在LAMP反應前，鈣黃綠素與錳離子結合，淬滅熒光顯橙色；當LAMP反應時，錳離子被釋放并與焦磷酸根結合產生焦磷酸錳沉淀，鈣黃綠素與殘留的鎂離子結合，恢復至綠色熒光[51]。如以鈣黃綠素作為指示劑，檢測到了2.2×102CFU的黃桿菌[50]。

3.2 基于熒光指示劑的LAMP生物傳感器

常見的熒光指示劑有SYBR Green Ⅰ[52]、EvaGreen[53]、溴化乙錠[54]、碘化丙啶[55]、PicoGreen[56]、SYTO-81和SYTO-9[57]、隱色三苯甲烷[58]等。SYBR Green Ⅰ本身具有可忽略的熒光，但是嵌入到靶DNA的小溝中，熒光會增強數千倍，同時顏色從橙色變為綠色[59-61]，該變化在紫外下肉眼可見。Chen等[52]利用該方法檢測豬肉中的金黃色葡萄球菌，得到了50 CFU/mL的檢測限。在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實時定量PCR儀檢測體系中的熒光變化，即可實現實時熒光檢測。如Seyrig等[9]在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實時定量PCR儀檢測體系中的熒光變化，能夠檢測到10個拷貝的青枯雷爾氏菌基因。

含特定序列的LAMP擴增子在特定條件下折疊成G-四聯體并結合氯高鐵血紅素后，除了使用比色生物傳感器檢測信號，還可以向體系中加入魯米諾(luminol)等熒光指示劑激發熒光，通過檢測420 nm處的吸收峰監控LAMP反應，如Xu等[62]利用該方法檢測到了50 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。

各類比色指示劑的變色情況有一定差異，為了方便選擇用于檢測LAMP產物的比色指示劑，總結了部分典型熒光指示劑反應前后的顏色變化與對反應的抑制作用，具體見表1。

表1 各種熒光指示劑的比較Table 1 Comparison of various fluorescent indicators

3.3 基于熒光基團的LAMP生物傳感器

在FIP和與FIP互補的F1c探針上分別修飾熒光基團和淬滅基團，將兩者退火雜交。隨著LAMP反應的進行，探針剝落下來，反應體系發出熒光，Tanner等[64]使用該方法檢測噬菌體HeLa基因組，得到了10 pg的檢測限。同時，該方法還可以通過修飾多種不同的熒光基團和淬滅基團，從而實現多重LAMP檢測。

3.4 其他LAMP熒光生物傳感器

生物發光的原理是LAMP反應時釋放的焦磷酸根離子在腺苷三磷酸硫酸化酶(ATP sulphurylase)催化下與硫酸銨(ammonium persulfate，APS)反應形成ATP，ATP、底物熒光素(luciferin)和O2又在熒光素酶(luciferase)的催化下生成一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、焦磷酸根離子、CO2和光。Kiddle等[65]利用該原理檢測轉基因玉米中的CaMV35S啟動子和NOS-t終止子，能夠測定0.1%污染水平的轉基因玉米。

4 LAMP電化學生物傳感器

4.1 基于電化學活性物質的LAMP生物傳感器

利用電化學方法檢測具有快速、成本低、操作簡單、更易小型化等優點，基于電化學活性物質與靶標DNA結合會引起測量電流變化的原理，按照電化學活性物質與靶DNA結合特點的不同可分為結合探針和嵌合劑2種類型[66]。①使用結合探針：在基底上修飾特異性靶向靶標DNA的寡核苷酸探針，LAMP反應中隨著靶DNA濃度的增大，探針不斷捕獲靶DNA并產生電信號變化。②使用嵌合劑：LAMP反應中隨著靶DNA濃度的增大，靶DNA與嵌合劑結合增加并產生電信號變化。關于電信號的檢測，通常使用線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry，LSV)[67]、方波伏安法(square wave voltammetry，SWV)[68-69]、差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)[70-71]、循環伏安法(cyclic voltammetry，CV)等。

根據電化學傳感器能否及時檢測，可以分為終點檢測與實時檢測。①終點檢測。以結合探針Hoechst 33258為例，在溶液中Hoechst 33258與靶DNA小溝結合可導致電極表面電子大量還原，電流響應顯著下降。Safavieh等[67]采用Hoechst 33258定量檢測大腸桿菌，在1 h內得到了24 CFU/mL的檢測限。②實時檢測。以嵌合劑亞甲基藍(methylene blue，MB)為例，MB遇到電極會轉移電子并產生電流。LAMP反應開始，MB嵌入靶DNA中，引起自由的MB濃度變化，從而引起氧化電流變化[72-73]。Hsieh等[72]使用MB作為指標，檢測到了16個拷貝(4 fg/mL)的沙門氏菌invA基因。

4.2 基于非電化學活性物質的LAMP生物傳感器

LAMP反應中產生的焦磷酸根離子可以在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸根，磷酸根可以和特定的金屬鹽反應生成具有氧化還原介體性質的沉淀物沉積在電極表面，進而引起電化學信號的變化，該方法可以用于實時檢測。Xie等[3]在LAMP反應體系中加入酸性鉬酸鹽，利用循環伏安法測定電信號，檢測到了17 fg/μL家蠶微孢子蟲病的病原體的PTP1基因組。

LAMP反應時，pH的變化與擴增產率之間存在強烈的相關性，所以可以通過檢測H+來監測LAMP反應[74]。針對H+的檢測方法可以分為直接法和間接法。①直接法?？墒褂胮H計直接測量溶液的H+變化[15]。此外，還可利用場效應原理開發的離子敏感場效應傳感器進行檢測，只是此類傳感器依賴于流體柵極電位的建立，需要對參考電極進行復雜的微加工[75]。如Veigas等[76]設計了Ta2O5離子場效應傳感器用于檢測人類c-myc原癌基因，得到了108～1011個拷貝的檢測范圍。②間接法。通過pH計檢測LAMP反應中的H+變化雖然便攜、快速，但是靈敏度較低。通過H+對特定靶DNA復合物的作用，聯級放大電化學信號，從而可以較大程度的提高靈敏度。Zhao等[77]開發了一種新型電化學傳感器間接檢測H+，首先將二茂鐵探針(Fe-Sp)和Au-Fe3O4修飾的具有特定序列的DNA(Ts)在pH 8.0的條件下雜交，在外磁場的作用下分離之后得到pH依賴型的復合探針(DNA NSs)。在H+的作用下，DNA NSs中二茂鐵探針發生構象變化并被釋放，剩下的結構將在H+的作用下折疊成穩定的DNA三聯體結構。針對二茂鐵探針設計捕獲探針并修飾在電極表面，讀取電化學信號的變化，可以間接檢測到0.31 fg/μL的蠶微粒子蟲的PTP1基因。

5 其他LAMP生物傳感器

5.1 表面等離子共振生物傳感器

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SRP)是一種光學現象，當一入射波射入金屬中，金屬表面極化并產生金屬表面等離子波(surface plasmon waves，SPW)，當入射波沿界面方向的波矢分量和SPW的波矢相同時就會發生表面離子共振，使反射波能量被SPW吸收而急劇下降，從而在反射光譜上形成明顯的吸收峰[78-79]。SPR吸收的光的波長與金屬表面接觸的介電膜的折射率直接相關，所以SPR生物傳感器測定的主要參數是溶液折射率的變化。①需修飾的SPR生物傳感器。在傳感器表面固定鏈霉親和素，并設計修飾有生物素的引物。LAMP反應過程中生成大量生物素化的LAMP擴增子結合到傳感器上，引起傳感器表面折射率發生變化，利用SPR生物傳感器測量溶液的折射率變化即可直接監測LAMP反應。Kawin等[80]利用該方法檢測耐甲氧林金黃色葡萄球菌的femB和mec片段，得到了10個拷貝/μL的檢測限。②無需修飾的SPR生物傳感器。LAMP反應過程中LAMP產物與Mg2P2O7的濃度變化會引起溶液的折射率變化，Chuang等[81]利用此原理測量溶液的折射率變化，直接檢測到了2 fg/mL的乙肝病毒。

5.2 巨磁阻生物傳感器

巨磁阻(giant magneto resistive，GMR)效應基于量子力學磁阻效應，在由交替的鐵磁和非磁導電層組成的薄膜結構中可以產生，基于此原理開發的GMR生物傳感器具有高靈敏度、低成本、寬探測范圍等優點[82]。利用抗體-抗原相互作用(如鏈霉親和素與生物素)將生物分子化的寡核苷酸探針、靶DNA和磁性納米團簇依次固定在傳感器上，在外置磁場的作用下，由于巨磁阻效應，傳感器測得的電阻值將發生變化。當LAMP反應時，記錄并比較前后的電阻值變化，電阻值變化的2倍大于參考值則為陽性。Zhi等[83]將生物素作為生物分子，利用該方法檢測到了10個拷貝/mL的B型乙肝病毒。

5.3 壓電石英生物傳感器

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)利用了石英晶體的壓電效應，將石英晶體電極表面的質量變化轉化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化，進而通過計算機等其他輔助設備獲得高精度的質量數據。在QCM表面修飾鏈霉親和素、LAMP引物修飾生物素，當LAMP反應時，生物素化的LAMP產物結合到QCM表面上，引起QCM信號變化[84]。根據QCM信號與LAMP濃度之間的關系進行換算，即可得到LAMP反應的擴增效率[84-85]。Prakrankamanant等[84]利用該方法檢測人乳頭瘤病毒DNA 58型，得到了100個拷貝的檢測限。

5.4 表面增強拉曼散射生物傳感器

表面增強拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，SERS)效應是一種與粗糙表面相關的表面增強效應，通常發生在Ag、Au和Cu等具有粗糙表面的納米粒子上[86]。在金納米粒子上修飾與LAMP擴增產物部分互補的寡核苷酸鏈和拉曼活性染料，當存在靶標時，LAMP反應產生的大量LAMP擴增產物與金納米探針雜交，雜交雙鏈不能被S1核酶(一種特異性單鏈核苷酸內切酶)降解，因而保持較高的拉曼信號；當不存在靶DNA時，金納米探針的寡核苷酸鏈被S1核酶分解，拉曼信號降低。該方法的檢測靈敏度較高，可以檢測到66 CFU/mL的沙門氏菌[87]。

各類生物傳感器的特點各異，使用時應根據所需的靈敏度、特異性以及預算成本進行選擇。因此，對各種主要輸出方式的特點進行了比較，具體見表2。

6 展望

LAMP作為新興的基因擴增技術具有快速擴增、操作簡單和易于檢測等優點，因此近年來獲得了突飛猛進的研究進展。然而，根據對LAMP生物傳感器的總結發現其還存在以下不足：LAMP引物設計復雜，優化條件費時費力；引物互補易出現非特異性條帶，導致產生假陽性的結果；整個實驗過程中也容易被氣溶膠污染，使陰性對照組出現擴增條帶。而且，目前LAMP的檢測和輸出方式大多停留在簡單體系，較少應用于食品、動植物等的現場快速檢測。此外，關于目前發展前景較好的微流控技術，也還存在設計復雜、工作量大且價格昂貴等問題。

若要突破研究中的瓶頸、解決技術上的不足，可加強對LAMP反應機理的研究，提供強有力的理論支持，從而引入更多創新的檢測信號的方法，也有助于建立健全高效的LAMP引物設計和LAMP反應體系優化系統。而針對LAMP非特異性擴增造成的假陽性，可以通過增強劑或特殊方法提高LAMP的特異性。目前，LAMP檢測的靈敏度較高，可以適當降低檢測的靈敏度，將靈敏度控制在實用范圍內即可，應更多地針對LAMP擴增過程中除擴增產物外的產物(如焦磷酸根和Mg2+)，開發簡單、快速、實用并且相對靈敏和可靠的生物傳感器。為了使LAMP更廣泛的應用于現場快速檢測，研究內容應該延伸到復雜的體系中，并研究其他體系環境的影響因素，并建立完整、實用的檢測方法；輸出方式也應該更多的向小型化、自動化發展，使操作更為簡易，適合于非專業人員現場檢測；同時，傳感器的設計應向電化學技術方向發展，因為相比于光學技術，電子傳感器具有更高的靈敏度，而且更易實現小型化、自動化。

表2 各種LAMP信號檢測方法的比較Table 2 Comparison of various LAMP signal detection methods