CRISPR-Cas生物傳感器研究進展

李凱,羅云波,許文濤*

1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京 100083;2.中國農業大學,農業農村部農業轉基因生物安全評價(食用)重點實驗室,北京 100083

CRISPR系統源于細菌體內的免疫系統，能夠對外來核酸分子進行識別和剪切。由于CRISPR系統特異性的識別機制，研究人員將其開發成為新型的基因編輯技術，使其成為最熱的分子生物學工具。以CRISPR-Cas9體系為代表的編輯系統已經成功應用于農業、醫學、生物學等領域，如用于建立新型育種方式、研制新型基因藥物以及探索生物體內通路等。CRISPR應用最多的為基因編輯領域，CRISPR技術能夠準確的靶向目標實現定點切割,促使胞內自動修復系統完成對靶標序列堿基的替換和缺失。近年來，雖然CRISPR技術脫靶效應產生的潛在風險逐漸被發現，但是隨著該技術的不斷發展和完善，問題也會隨之逐步解決。CRISPR與靶標序列的特異性結合方式成為了一種特殊的信號識別機制，可以應用在生物傳感領域。越來越多的研究人員開始以CRISPR系統為基礎，與其他技術結合在一起，如等溫擴增技術(recombinase polymerase amplification)、電化學傳感、光學顯色等,以建立特殊的生物傳感器。此類傳感器具有識別特異性強、檢測靈敏度高、簡單方便等特點。因此本文綜述了基于CRISPR-Cas生物傳感器的研究進展，以期為生物傳感器的相關研究提供參考。

1 CRISPR-Cas系統

1.1 CRISPR-Cas系統的發現

CRISPR/Cas是來源于一類廣泛存在于細菌及古細菌中的適應性免疫系統。1987年，日本科學家Ishino等[1]克隆并測序了iap基因，該基因負責大腸桿菌中堿性磷酸酶同工酶的轉化。隨后他們在研究中克隆并測序發現，在iap的下游有一組由29個核苷酸組成的重復序列被非重復、類似的短序列分開，這是首次對CRISPR特殊結構進行報道。在2002年，Jansen等[2]創造了術語“CRISPR”以反映這些特定結構。通常，重復簇之前是“前導”序列，AT富集區域有幾百個堿基對，具有種內保守性，但不具有種間保守性。CRISPR保守蛋白編碼基因，通常存在于整個基因座的一側。對幾個CRISPR基因座中間隔序列的分析表明，間隔區匹配來自外源遺傳元件的序列，如噬菌體和質粒[3]。2007年，Barrangou等[4]的一項開創性研究首次證明了CRISPR序列是一種適應性免疫途徑，可保護嗜熱鏈球菌免受噬菌體感染。Cas位點編碼的多個核酸酶和解旋酶可以把入侵的噬菌體DNA 切割，然后整合到CRISPR 的重復序列中。當下次再遇到相同噬菌體入侵時，細菌轉錄RNA-Cas 蛋白復合物利用這些與入侵噬菌體DNA 同源的RNA去切割外源的DNA，從而達到識別并對抗噬菌體感染的目的。

1.2 CRISPR-Cas系統分類

CRISPR-Cas系統包含多種類型，CRISPR-Cas系統大致分為兩大類(圖1)：1類系統依賴于多亞基蛋白質復合物共同作用，而2類系統利用單個蛋白質。在這兩類系統中，根據能夠表達Cas蛋白的種類的不同，到目前為止可分為I型、II型、III型、IV型、V型和VI型(圖1未包含VI型)，其中I、III、IV屬于第一大類，II、V、VI屬于第二大類。隨著對細菌免疫系統基因組功能的不斷挖掘，新型的CRISPR-Cas系統也逐漸被認識。

I型CRISPR-Cas系統中具有特殊的cas3基因，能夠編碼出同屬具有解旋酶活性以及DNase活性的大分子蛋白質。I類系統中還具有編碼多種其他蛋白的基因包括cas5、cas6和cas7，這些基因表達出來的蛋白會與Cas3蛋白相互結合形成復雜復合體共同行使作用。此外，參與CRISPR-Cas功能的復合蛋白中可能還包括BH0338，這類大蛋白家族以及Cse1和Cse2這類小的α-螺旋蛋白。CRISPR-Cas系統中表達的串聯蛋白復合體能夠加工前體crRNA，使之轉化為成熟crRNA。

圖1 CRISPR-Cas系統分類圖[5]Fig.1 Classification figure of CRISPR-Cas system[5]

II型CRISPR-Cas系統中最為人熟知的是CRISPR-Cas9。II類系統中包含特殊的cas9基因以及csn基因，根據csn的不同類型可將II類系統分為兩個亞型，分別包含csn2和csn4基因。Cas9蛋白是一種功能十分強大的蛋白質，具有識別crRNA以及切割靶標DNA的能力。Cas9蛋白具有兩個核酸內切酶的結構域，位于蛋白N端的RuvC和中部NHN，分別負責切割外源DNA與間隔序列的互補鏈和外源DNA的另外一條鏈。在整個切割過程中，首先tracrRNAs和前體crRNA中的重復序列雜交，再與Cas9蛋白進行結合，通過RNaseIII對RNA復合體進行切割，形成不同類型的成熟crRNA-tracrRNA-Cas9復合體。形成的成熟復合體再通過PAM序列識別進行外源DNA切割。

III型CRISPR-Cas系統以cas10基因為標志基因，先前根據可以表達csm2和cmr5兩種亞基分為兩個亞型：III-A和III-B。現已證明亞型III-A和亞型III-B CRISPR-Cas系統可以靶向RNA和DNA。后來研究人員發現了另外兩種III型系統：III-C和III-D。III-C亞型的顯著特征是Cas10蛋白的環化酶活結構域的明顯失活。亞型III-D基因座通常編碼缺乏HD結構域的Cas10蛋白，但它們還含有一種獨特的cas5基因，也稱為csx10。這兩種新亞型都缺少cas1和cas2基因，但整個系統具有完整的功能性。

IV型CRISPR-Cas系統是在不常見的幾種細菌的質粒上發現的一種新型CRISPR-Cas系統，csf1基因是該系統的標志性基因。系統基因座的組成大部分與III-B亞型類似，缺少cas1和cas2基因。IV型系統可以編碼出最小的蛋白復合體對crRNA進行加工，其中包括Csf1、Cas5和Cas7蛋白。IV型CRISPR-Cas系統有兩種不同的亞型，其中一種含有DinG家族解旋酶，第二種缺乏DinG但通常含有編碼小α-螺旋蛋白的基因，類似于亞型III-B系統，可以對多種重復回文系列進行crRNA的加工。

V型CRISPR-Cas系統是基于在一種古細菌基因組發現的獨特cpf1基因，后續也在幾種不同細菌基因組中發現了該系統的基因序列。該系統中cpf1基因與cas1、cas2、cas4和CRISPR序列相鄰，能夠表達Cpf1蛋白。Cpf1包含約1 300個氨基酸，具有跟Cas9相類似的RuvC結構域，并且與精氨酸富集結構和鋅指結構相連接。雖然Cpf1缺乏Cas9蛋白中的HNH核酸酶結構域，但V型系統能夠對外源DNA進行準確的識別和切割，從而對細菌起到保護防御的作用[6]。

VI型CRISPR-Cas系統是2015年張鋒與俄國科學家Koonin通過電腦分析得出的一種新型的CRISPR-Cas系統[7]，包括cas1、cas2、c2c2和CRISPR序列。該系統的特殊基因為c2c2基因，能夠編碼C2C2蛋白。該蛋白具有兩個HEPN(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding)結構域，具有RNase活性能夠實現對RNA的識別和剪切。通常認為該系統是在細菌防御外源核酸入侵時，針對RNA設立的第二防線。

1.3 CRISPR-Cas生物傳感器在檢測成像中的應用前景

核酸作為重要的生物標志物，其在體內的含量信息和位置信息都是相關疾病診斷中重要的參考條件。針對于DNA或者RNA檢測成像技術的開發，已經成為重要的研究領域之一。以往的檢測成像技術以體外擴增、蛋白雜交、微矩陣等技術為基礎，雖然可以實現對于靶標的檢測成像要求，但是在時間、成本、精準度、靈敏性方面都存在著一定的缺陷，所以需要建立更加快速準確的檢測成像新手段。

隨著CRISPR-Cas在細菌免疫過程中的相關機制研究越來越清晰，以及多種類型的Cas蛋白不斷發現，CRISPR-Cas復合體對于外源DNA和RNA的高效特異性識別機制引起了研究者們的關注。例如雙鏈DNA序列特異性的Cas9蛋白酶、Cas12a蛋白酶，以及RNA序列特異性的Cas13a蛋白酶等。通過對CRISPR的體外定向修飾，建立了一定的邏輯機制，再結合不同剪切屬性的Cas酶可以建立起一系列基于CRISPR-Cas技術的檢測和成像傳感器，此類傳感器利用CRISPR-Cas高特異性的識別機制，能夠滿足高精準檢測成像要求，在疾病預防診斷方面具有廣闊的應用前景。

2 CRISPR-Cas9生物傳感器介導的檢測技術

CRISPR-Cas9系統由于Cas9蛋白的多功能特性，利用其DNA靶向剪切產物進行循環放大以及信號輸出的方式可以對DNA核酸進行高效檢測。東南大學生物電子學國家重點實驗室王進科教授團隊利用Cas9蛋白的這一性質，建立了CRISPR-PCR檢測方法靶向檢測人乳頭瘤病毒DNA[8]。在人乳頭瘤病毒保守序列上選取兩處sgRNA (single guide RNA)識別區域，建立sgRNA-Cas9復合物。首先利用PCR技術將該保守序列進行初步擴增，將PCR產物中加入sgRNA-Cas9復合物進行特異性切割，剪切產物利用Taq酶在末端鏈接鳥苷酸，并將剪切產物連接到T載體上，最后利用含有T載體以及切割產物序列的特異性引物對連接好的質粒進行PCR，最終實現5 ng靶標DNA的檢測(圖2)。該方法還同樣適用于qPCR進行實時熒光檢測。

與上述方法原理類似，王進科教授團隊還建立了一種基于CRISPR-Cas9技術的反向PCR技術應用于DNA檢測[9]。該方法在靶標DNA片段上游、下游分別設計一條sgRNA，當Cas9蛋白發生特異性剪切后會形成雙鏈片段，利用雙鏈片段設計的反向引物進行PCR擴增可以使剪切產品進行分子內成環或形成多片段產物(實驗驗證產物為環狀結構)，在通過電泳或者qPCR熒光進行結果的信號輸出(圖3)。該方法可以在1.5 h內檢測到0.02 ng的樣品。

圖2 CRISPR-PCR檢測原理圖[8]Fig.2 The detection principle of CRISPR-PCR[8]

由于CRISPR-Cas9在識別基因組低拷貝靶標基因時，其識別以及剪切的效率較低，為將靶標含量提高到CRISPR-Cas9有效范圍內，往往會在進行Cas9剪切之前利用PCR或等溫擴增技術進行靶標的初步擴增，CRISPR-Cas9系統僅用于終點分析，這在很大程度上限制了檢測技術的發展。鑒于此，中國科學院深圳先進技術研究院生物醫學材料與界面中心喻學鋒研究員團隊，建立了CRISPR-Cas9觸發的切口核酸內切酶介導的SDA(strand displacement amplification)方法(CRISDA)，用于靈敏擴增和檢測雙鏈DNA[10]。CRISDA技術充分利用了具有高靈敏度、高特異性和高獨特性的CRISPR-Cas系統識別靶DNA并釋放單鏈結構的特性，結合穩健的肽核酸(PNA)介導的終點測量，在復雜樣品背景下實現了amol級檢測和單堿基檢測。在進行了一系列概念驗證后，CRISDA能夠在人體基因組、轉基因玉米基因組等復雜背景條件下實現靶向的超靈敏檢測。首先，設計一對sgRNA(sgUPS/DNS)與Cas9蛋白結合，識別靶DNA的每個邊界并在兩個非靶標鏈中誘導一對切口(圖4，步驟1)。隨后，引入一對引物以啟動SDA反應(起始引物對，IPUPS/DNS)并與暴露的非靶標鏈雜交(步驟2)。每個IP引物含有5′Nb.BbvCI核酸內切酶切口位點，與暴露的非靶鏈互補的中間雜交區和與非靶鏈的雙鏈區互補的3′突出端。加入SDA混合物后，DNA聚合酶在單鏈DNA結合蛋白TP32的幫助下沿非靶鏈延伸IP引物。同時，暴露的非靶鏈也通過DNA聚合酶從Cas9誘導的切口位點延伸到退火的IP引物的5′末端，產生雙鏈Nb.BbvCI核酸內切酶切口位點。另外，Nb.BbvC、聚合酶和SSB一起反Cas9結合位作用以沿著靶DNA給予相點的線性鏈置換反應(步驟3)。然后，將線性置換的單鏈Strand-For和Strand-Rev分別與引物IPDNS和IPUPS退火，進一步在90 min內誘導所選靶序列的指數擴增，得到產物1～3(步驟4)。最后，添加靶向擴增子的生物素標記和Cy5標記的PNA探針，并在簡單的磁性下拉后通過Cy5的熒光強度定量測定擴增的靶標DNA(步驟5)。

圖3 CRISPR介導的反向PCR檢測原理圖[9]Fig.3 The principle of reverse PCR detection based on CRISPR[9]

圖4 CRISDA超靈敏檢測DNA原理圖[10]Fig.4 The principle of ultrasensitive DNA detection based on CRISDA[10]

CRISPR-Cas9系統與等溫擴增技術相結合可以有效提高檢測靈敏度，實現超靈敏檢測。但是，在實際基因組DNA檢測中，PAM位置的不可選擇性為建立CRISPR-Cas9切割位點制造了障礙。不過有報道稱，Cas9-sgRNA復合物在有PAM獨立單鏈存在的條件下，就可以對ssDNA或者ssRNA進行特異性識別和剪切[11-12]。根據這個特點，華南師范大學邢達教授團隊在利用人為添加PAM序列的基礎上，將CRISPR-Cas9系統與恒溫指數擴增(isothermal exponential amplification reaction,EXPAR)相結合建立了CAS-EXPAR核酸檢測模型[13]。整個反應原理如圖5A，使用與PAM序列互補的李斯特菌溶血素基因片段作為靶模型。首先，sgRNA被設計為包含三個區段：20 nt指引序列、30 nt雙鏈互補區域和3個tracrRNA莖環。sgRNA可以與Cas9結合以形成活化的Cas9/sgRNA復合物，其可以進行靶標的位點特異性切割。其次，設計EXPAR模板(T)以執行隨后的指數擴增，其中心位置具有NEase識別序列，兩段式能夠與Cas9切割的靶片段(X)互補的側翼區(X′)。通過這些設計，X與T的3′末端區域的X′雜交形成復合物(TX)，并作為DNA聚合酶的引物，合成具有完整識別序列的雙鏈DNA。然后，NEase在形成的dsDNA中切割T的互補鏈，并且DNA聚合酶可以依次延伸切割的dsDNA，同時置換X。釋放的X可以與另一個T雜交以再次觸發擴增。通過CRISPR/Cas9介導的切割、NEase切割、聚合酶延伸和鏈置換的反應，可以產生大量的dsDNA。結果表明，該方法的檢出限為0.82 amol，并且在鑒別單堿基錯配方面表現出極佳的特異性。利用相同原理，華南農業大學劉英菊教授團隊建立了基于CRISPR-Cas9技術的比色傳感器并成功用于鑒定致病疫霉基因組DNA[14]。該方法利用CRISPR-Cas9特異性切割出發擴增反應并將金納米顆粒(AuNPs)作為光學探針，最后通過AuNPs的聚散程度導致顏色從酒紅色到紫色的變化進行判斷(圖5B)。可視化檢測極限為2 pmol，通過吸光度測量值判斷的線性范圍在0.2 pmol/L～20 nmol/L之間。

A：CRISPR-EXPAR反應原理圖；B：CRISPR識別機制偶聯RCA滾環擴增實現核酸顯色檢測 a—CRISPR-Cas識別、剪切特異性位點；b—EXAPR實現單鏈富集并觸發RCA滾環擴增；c—金納米富集產生顏色變化。圖5 CRISPR-EXPAR反應原理與CRISPR識別機制偶聯RCA滾環擴增實現核酸顯色檢測[13-14]Fig.5 The principle of CRISPR-EXPAR and color method of DNA detection based on CRISPR-EXPAR assay[13-14]

3 CRISPR-dCas9生物傳感器介導的檢測技術

CRISPR-dCas9系統是將Cas9蛋白的RuvC和NHN兩個核酸酶活性區域同時進行了突變，成為剪切功能去除后的突變體，該突變體不具有核酸酶活性但是仍然保留了高特異的識別能力。研究人員已經將這種功能蛋白有效的利用在識別和成像等領域。

韓國蔚山大學醫學院Yong Shin教授將CRISPR-dCas9系統、RPA等溫擴增技術以及硅微環諧振器(silicon mirroring resonator,SMR)相結合，在硅微環諧振器上完成核酸的檢測[15]。為了能夠同時擴增和檢測核酸，該方法將靶序列特異性引物固定在SMR生物傳感器表面，引物在恒定溫度條件下進行RPA等溫擴增反應(圖6)。對于DNA，引物結合重組酶以延伸DNA；對于RNA，通過RT-RPA進行擴增。擴增產物中含有能夠被dCas9-sgRNA復合體識別的序列，dCas9與傳感器表面上的擴增產物結合并增加傳感器表面的分子量，從而通過增加折射率變化來增加檢測靈敏度。該方法在20 min內可以完成對靶標的檢測，通過對蜱傳相關疾病檢測應用，可以達到0.54 amol，這種檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高100倍。

圖6 CRISPR介導的SMR傳感器原理圖[15]Fig.6 The principle of of SMR biosensor mediated by CRISPR[15]

國防科技大學朱凌云團隊將CRISPR-dCas9系統與滾環體外核酸擴增技術應用到生物傳感器中建立了RCA-CRISPR-split-HRP傳感器，實現了對miRNA的快速高效檢測[16]。其原理是靶標miRNA促發RCA擴增形成多種發卡狀結構，再通過sgRNA-dCas9系統將批量的HRP酶活蛋白重新靠近產生活性，最后通過加入TMB發生顯色反應實現對靶標miRNA的檢測(圖7A)。該方法能夠實現fmol級別、單堿基差異的miRNA檢測。該團隊還利用上述方法制作試劑盒，該試劑盒在實地檢驗過程中可以在37℃條件下對于血液樣品4 h內完成，并且試劑盒保質期可以達到一年(圖7B)。

dCas9-sgRNA復合體能夠通過堿基互補配對與靶標進行結合，這種結合方式與抗原抗體免疫結合相類似。利用這種識別機制，韓國生物科學與生物技術研究所Juyeon Jung研究團隊設計了基于dCas9-sgRNA的核酸熒光原位雜交顯色傳感器用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的檢測[17]。體外表達的dCas9一端連接磁性納米顆粒，通過與sgRNA結合后對MRSA基因組特異性片段識別(反應時間30 min)。結合后，通過磁力進行吸附洗脫，若樣品中含有靶標序列，dCas9-sgRNA-靶標-磁珠復合物將吸附停留在檢測池，加入DNA雙鏈熒光染料SYBR Green I，通過判斷是否產生綠色進行MRSA的可視化檢測(圖8)。通過測得溶液熒光強度可以進行定量檢測，檢測限為10 CFU/mL。該方法舍去了常用檢測方法中對于靶標序列的擴增過程，有效減少了時間。結果通過顏色變化能夠更加直觀的體現結果，從而有效的實現MRSA病原菌的現場快速檢測。

A：CRISPR-Cas9介導的RCA等溫擴增生物傳感器原理；B：CRISPR-RCA試劑盒制作流程。圖7 CRISPR-Cas9介導的RCA等溫擴增生物傳感器原理與CRISPR-RCA試劑盒制作流程[16]Fig.7 The principle of RCA amplification biosensor mediated by CRISPR and the production progress of CRSIPR-RCA reaction kit[16]

A：CRISPR-dCas9介導FISH方法檢測MRSA原理圖；B：芯片原位顯色方法。圖8 CRISPR-dCas9介導FISH方法檢測MRSA原理圖與芯片原位顯色方法Fig.8 The principle of MRSA detection by CRSIPR-dCas9 mediated FISH biosensor and in situ detection method on chip

CRISPR-dCas9系統作為一種核酸特異性識別工具，通常需要對目標進行一定的擴增富集后才能更好的行使作用[18-19]。為了建立更加簡便的一步完成靶標識別的方法，研究人員開始引入納米材料構建方法。納米材料由于其優越的物理性質，可以通過靈敏的光學性質進行信號輸出。荷蘭代爾夫特理工大學Kavli納米科學研究所的Cees Dekker團隊建立了基于CRISPR-dCas9的固態納米孔對DNA進行檢測[20]。該方法首先將靶RNA與dCas9預孵育，然后與靶標DNA樣品混合(圖9A)。使結合CRISPR-dCas9的DNA通過固態納米孔，其中dCas9蛋白結合的DNA信號能夠產生明顯的特征，從而鑒定特定的DNA序列(圖9B，C)。并且，該團隊還驗證了在高鹽濃度下，該體系仍然適用。由于dCas9蛋白增大了流體動力學半徑，使得靶標信號增強，即使在大孔徑條件下仍然可以實現靶標檢測。該團隊成功應用該方法對DNA進行了分型，并且預測該方法可以應用到疾病菌株的快速鑒定、抗生素抗性檢測以及基因組的分型中。

A:CRISPR-sgRNA結合靶DNA；B:CRSIPR識別復合體通過固態納米孔；C:電流變化實現DNA檢測圖9 基于CRISPR-dCas9的固態納米孔檢測DNA[20]Fig.9 DNA detection of solid state nanopore biosensor based on CRSIPR-dCas9[20]

4 CRISPR-Cas12a生物傳感器介導的檢測技術

CRISPR-Cas12a蛋白也叫做Cpf1蛋白，屬于第二大類，第V型系統。該蛋白在RNA指導下，能夠結合并切割外源DNA，也是細菌免疫系統的組分。RNA引導的Cas12a結合DNA后具有切割任意單鏈DNA的活性，完全降解ssDNA分子。加州大學伯克利分校Jennifer A.Doudna教授發現Cas12a擁有這種特殊性質之后，通過將Cas12a與等溫擴增相結合，創建了一種名為DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的方法[21]。首先將血液樣本進行前處理，之后進行RPA的初步擴增。再將crRNA-Cas12a復合物以及進行熒光淬滅的ssDNA探針一起加入，當與雙鏈DNA特異性結合之后，活化Cas12a會無差別的切割ssDNA探針，從而釋放熒光信號(圖10)。該方法實現了對DNA在μmol級的檢測，并且DETECTR能夠快速、特異地檢測到患者樣本中的人乳頭瘤病毒，為分子診斷提供了一個簡單的平臺。

5 CRISPR-Cas13a系統介導的檢測技術

Cas13a蛋白又叫做C2C2蛋白，屬于第二大類的VI型CRISPR-Cas系統，是2015年張鋒和Koonin利用RNA測序技術分析得出新一類VI型CRISPR-Cas系統的代表[19]。Cas13a蛋白在與sgRNA形成功能性復合物后，再與靶RNA識別可以在形態學上激活Cas13a的非特異性反式核糖核酸酶活性，能夠對任意單鏈RNA進行剪切。CRISPR-Cas13a系統的出現掀起了針對RNA靶標的新型基因編輯應用浪潮。

圖10 DETECTR檢測雙鏈DNA原理圖[21]Fig.10 DNA detection principle by DETECTR biosensor[21]

根據以上性質，2017年張鋒團隊構建了基于CRISPR-Cas13a系統的傳感器,稱為SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking),實現了對DNA快速、廉價、高靈敏的檢測[19]。由于Cas13a/sgRNA系統識別底物為RNA序列，所以在進行DNA檢測時，需要后續進一步轉錄過程。SHERLOCK技術首先利用了RPA等溫擴增技術將樣品中的靶標DNA進行富集，經過T7轉錄法將DNA轉錄成單鏈RNA(圖11)。將構建好的crRNA-Cas13a復合體以及熒光RNA探針與樣品RNA混合，當樣品中存在與crRNA堿基互補的序列時，Cas13a的RNase酶活性激活會對周圍熒光淬滅RNA探針進行剪切從而釋放熒光信號。該團隊利用CRISPR-Cas13a傳感器實現了體外μmol級別的檢測并且可以識別單堿基的錯配，同時應用于寨卡病毒和登革熱病毒中特定菌株的檢測、區分致病菌、人類DNA基因分型，及鑒定無細胞腫瘤DNA突變等。此外，SHERLOCK反應試劑可以冷凍干燥，以實現長期儲存，并可在紙上輕松復原，為現場檢測應用提供了方法基礎。東南大學何農越教授團隊利用該技術成功實現了對禽流感H7N9病毒的現場檢測[22]，在5 min內可以檢到1 nmol級的RNA模板，與RT-RPA結合50 min內可以檢測到1 fmol級的DNA模板。

鑒于Cas13a對RNA的專屬識別機制，利用其建立針對miRNA的檢測方法更加準確、方便。邢達教授團隊首次利用纖毛菌體內的Cas13a建立了miRNA的檢測傳感器(圖12)[23]。該方法擺脫了對靶標序列預擴增的過程，有效的避免了基因組DNA污染的影響。該方法的高特異性不僅來源于crRNA與模板的堿基互補配對，Cas13a蛋白酶的高保真度使該方法能夠區分存在于miRNA末端的單核苷酸突變。利用此方法檢測miRNA，檢測線可達到4.5 amol級別，并且線性范圍跨越4個數量級，從10 amol級到100 fmol級。此外，在面對復雜生物樣品(血清)時，該方法也表現出了良好的應用效果。

圖11 SHERLOCK檢測核酸原理圖[19]Fig.11 Detection principle of SHERLOCK biosensor[19]

圖12 CRISPR-Cas13a檢測miRNA原理圖[23]Fig.12 miRNA detection principle of CRSIPR-Cas13a biosensor[23]

6 CRISPR-Cas系統在胞內成像中的應用

細胞中，基因組DNA呈現高度折疊狀態并存在于三維空間中。細胞核中染色質的空間組織和不同染色質區域的相對位置關系與正常發育和疾病中的基因調控緊密相關。通過對胞內的染色質結構域或基因進行可視化定位，能夠進一步用于疾病相關研究和診斷。傳統的胞內核酸成像多利用探針雜交技術，例如DNA熒光原位雜交技術。但傳統方法需要首先對基因組進行物理或者化學處理，例如通過熱和甲酰胺進行嚴格處理以使dsDNA變性以允許探針雜交，因此該方法存在影響生物結構和基因組組織完整性的風險，并且寡核苷酸探針的高成本也是傳統方法的一大缺陷。因此，開發更簡單有效、成本低廉和穩健的成像技術具有重要意義。

CRIPSR系統對于核酸序列的特異性結合方式為建立新型識別機制提供了新方法，并且Cas蛋白的生物相容性也為該系統實現胞內成像提供了生物安全保證。核酸酶缺陷型Cas9衍生物(dCas9)常常被用于胞內核酸物質的識別，通過結合不同熒光基團實現胞內物質的實時成像和原位成像。早在2013年，加州大學舊金山分校的黃波教授團隊通過優化的CRISPR-Cas系統對活細胞中的基因組基因座進行動態成像[24]。利用EGFP標記的dCas9和結構優化的sgRNA，成功的對端粒中重復元件和活細胞中編碼基因進行穩定成像(圖13A)。美國霍華德休斯醫學研究所的Robert H.Singer研究員團隊將此方法進行了改進[25]，在dCas9上連接不同熒光基團，實現對胞內基因組兩個基因座的原位成像(圖13B)。

以上幾種方式都是將熒光基團修飾在dCas9蛋白末端，信號的富集主要由胞內基因組上靶標序列的重復性決定。所以上述方法在建立時，都是針對于染色體著絲粒前端多重復系列進行設計成像的，在面對靶標序列為低重復甚至單拷貝時具有很大的局限性。研究人員后續利用CRISPR-dCas9進行了進一步的改良[26-27]，通過設計具有特殊發卡結構的sgRNA，將不同熒光蛋白連接到相應發卡位置，能夠實現熒光信號的富集，再通過與靶標序列結合，完成胞內核酸序列的成像(圖13C，D)。

A：EGFP標記的dCas9對端粒中重復序列的準確成像；B：雙熒光標記的dCas9實現基因組雙基因座成像；C,D：熒光標記sgRNA實現胞內核酸成像圖13 基于CRISPR-dCas9技術的胞內核酸成像[24-27]Fig.13 Intracellular nucleic acid imaging by biosensor based on CRSIRP-dCas9[24-27]

7 展望

CRISPR-Cas技術作為當下最常用的基因編輯工具，被廣泛的用于新品種培育、基因通路研究以及基因藥物研制等領域，并取得了巨大的成功。但是，關于CRISPR技術的負面報道也經常出現，最受關注的即CRSIPR技術的脫靶效應問題。一些報道指出，CIRSPR系統介導的體內編輯基因組DNA雙鏈斷裂修復會產生大量脫靶效應，極有可能造成切割位點遠端DNA大片段丟失、乃至其他更為復雜的基因突變[28-29]。雖然，有些研究報道后被撤回，但關于CRISPR技術的潛在風險引起了人們對于該技術在醫學領域應用的擔憂。此外，該技術應用于體內還面臨著很多挑戰，如編輯效率以及遞送方式等問題。但是，毫無疑問的是CRIPSR的時代已經來臨，越來越多的研究人員已經投入到此項技術的改進和完善工作中。多種基于新型CRISPR系統的編輯工具逐漸被開發出來。為了避開其潛在的風險，我們可以利用這種新型的技術應用于疾病相關檢測、成像領域。通過多種跨學科技術的聯用建立生物傳感器，將CRIPSR系統的優勢發揮到最大。建立多重邏輯關系，通過核酸實現多種疾病標志物的檢測，從而在分子水平上實現更高精確度和可靠性的疾病診斷。