不同波長LED光源對生物體離體細胞活性與形態影響的實驗研究

（金陵科技學院，南京 210000）

1 引言

21世紀以來，智能化的設備改變了人們的傳統生活方式，各式各樣的智能手機、平板，電腦、液晶電視不斷涌現，給人們的生活和工作帶來極大的便利。但是在人們使用智能設備的液晶屏幕時，藍光對人眼的危害也在同時進行。除了智能設備終端，隨處可見的LED液晶屏幕也是有害藍光的主要來源之一。液晶顯示屏采用的都是LED背光，由于背光需要白光的效果，所以通常使用藍色LED混合黃色熒光粉來形成白光。藍色LED是一個主體硬件，因此這種白光中的藍色光譜就擁有一個波峰。成年人眼晶狀體雖然對藍光具有較低的透過率，但長時間暴露在藍光下仍然會造成視網膜的退行性改變，形成光致視網膜炎。

有研究燈光與照明系統的學者將光源對人體的危害進行了4級分類，分別為無危險級別，低危險級別（1類），中危險級別（2類）和高危險級別（3類），分類的主要依據是光源的輻射亮度以及人體產生不適感覺的主觀程度，但對于不同波長的光源輻射以及輻射不同時間下的生物組織狀態變化則研究較少。本文采用LED光照射生物體離體培養的細胞，控制使用不同波長的光源和不同的照射時間，來研究輻射參數對人體離體細胞的活性與形態的變化，通過分析實驗數據，對人體離體細胞受光輻射危害的程度做出判斷。

2 材料與方法

2.1 材料

研究中為了確定不同波長的光對細胞的影響，選擇光源分別為紫光LED，其主要波長范圍為395nm～400nm；藍光LED，其主要波長范圍為450nm～460nm；紅光LED，其主要波長范圍為620nm～630nm；以及白光LED，其輸出功率相同，均為4.5W。而實驗對象則選擇細胞為人體離體細胞，其原因為選用活體細胞則可能由于自身代謝較快而對結果產生較大影響，導致結論的不準確。

2.2 方法

細胞活性是判斷體外培養細胞在某些條件下是否能正常生長的重要指標，如藥物處理、放射或紫外線照射、培養條件變化等，它是從事相關方面的科學研究的常用手段，更是體外篩選抗腫瘤藥物和臨床腫瘤藥敏試驗的重要方法之一。目前常用的方法很多，如有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素滲入法、MTT法、CCK-8法等。

當使用MTT法測試細胞活性時，需要使用裂解液溶解甲贊晶體沉淀，可能遇到顆粒不完全溶解以及在吸取上清的操作中也極易帶走部分細胞等問題，導致了MTT法的檢測穩定性不佳，對于重復性實驗，結果容易出現較大差異。為了實驗的操作方便以及實驗的準確度，本研究選擇了CCK-8法。CCK-8法使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑，能快速檢測，檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度，重復性優于MTT 法，對細胞毒性小，另外，CCK-8法中的細胞活性檢測試劑為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

CCK-8檢測細胞活性的原理：Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8[化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，通過酶標儀測量細胞液的吸光度值，便可檢測出待測細胞樣品的活性。

細胞活性測定

（1）當細胞貼壁生長密度達到80-90%后，棄掉培養基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等體積培養基吹打細胞，離心分離，再加入新培養基。

（2）調節細胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接種100ul細胞懸浮液，培養24小時。

（3）棄掉培養基，加新培養基100ul/孔，分別用4種不同光源（紫光、藍光、紅光、白光）對細胞分別進行光照1小時和2小時

（4）向每孔加入10ul CCK-8溶液，培養箱孵化1-4小時。

（5）用酶標儀分別測定1小時和2小時在450nm處的吸光度。

細胞形態測量

（1）當細胞貼壁生長密度達到80-90%后，棄掉培養基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等體積培養基吹打細胞，離心分離，再加入新培養基。

（2）調節細胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接種100ul細胞懸浮液，培養24小時。

（3）在未有光源照射時，先觀察每組細胞形態變化。

（4）再分別用4種不同光源（紫光、藍光、紅光、白光）對細胞分別進行光照1小時和2小時，在顯微鏡下觀察相同時間下每組細胞的形態變化。主要觀察細胞表面的形態是否規整，細胞的邊緣是否光滑，細胞的碎片是否很多，是否有細胞由黑點變成了亮點。

3 結果與分析

3.1 光輻射對細胞活性的影響

在細胞受光輻射之前測得其平均吸光度為0.1602875，再分別用紫光、藍光、紅光、白光LED照射細胞，測得1h和2h時的細胞吸光度。在1h時測得的細胞吸光度與未受光輻射時沒有明顯變化，而細胞受光輻射2h后測得的數據如下表：

表1 細胞受不同波長LED光照射2h后的吸光度平均值和方差表（單位：吸光度）

生物體細胞在受紫光LED照射2h后，吸光度下降較大，并且方差是所有結果中最高的，表明紫光照射對細胞產生了較為顯著且強烈波動的影響；而藍光照射2h后，細胞吸光度下降程度最高，表明該種波長的光與生物體作用最明顯，藍光產生的光化反應最多；紅光LED照射2h后，細胞的平均吸光度有所上升，表明該波長的光對細胞產生了一定程度的促進作用，使得吸光物質含量上升；白光的效果與藍光較為接近，但方差較小，表明了白光LED中具有與藍光接近的成分，但影響程度較為均衡。

對以上數據進行對比分析，可以得到以下結論：根據2h時的測得的細胞吸光度數據的方差，可以看出：藍光、紅光和白光對應的數據集中度相對較高，表明藍光、紅光和白光對細胞的影響程度比較均勻，而紫光對應的數據集中度相對較低，表明紫光對細胞的影響程度差異性較大。根據2h時測得的細胞吸光度數據的平均值，可以看出細胞在經過2h的不同波長光的照射情況下，藍光照射2h后的細胞所測得的細胞吸光度在四種光對細胞照射2h后測得的吸光度中數值最低，藍光對細胞的活性的影響最大，會使細胞活性處于最低的狀態，即藍光對細胞的危害程度最高。

3.2 細胞形態的分析

在細胞受光輻射之前拍攝其形態，再分別用紫光、藍光、紅光、白光LED照射細胞，用顯微鏡記錄受照射1h和2h后的細胞形態。結果顯示，光輻射1h后拍攝的細胞形態與未照射時幾乎無變化，而受光照射2h后拍攝的的細胞形態則出現較為明顯的變化，結果如下圖所示。

圖3 細胞受不同波長LED光輻射前后形態圖

圖中，（a）為人體離體細胞未受光輻射時形態圖，（b）（c）（d）（e）分別對應紫光、藍光、紅光、白光LED光輻射2h后的細胞形態。

對于以上的細胞形態圖片的分析，未照射時，細胞的形態比較規整，細胞的邊緣很光滑，細胞碎片不多。在受紫光、藍光、紅光和白光LED照射2h后，出現了與初始狀態較大的變化。其中受藍光照射2h后的細胞形態已經模糊，細胞的基本外形已消失，細胞碎片較多，而在受紫光和白光照射2h后的細胞中，有少許形態模糊的細胞和少許細胞碎片，紅光照射2h時的細胞中，細胞邊緣有變形，整體情況稍好。由此可見，在選擇的四種光中，藍光對細胞形態的損害最為嚴重，即藍光輻射對細胞的危害程度最高。

生物組織與常規光學介質不同，因為其內部結構非常復雜，包含了大量不同體積，不同種類的細胞，而每一種細胞的細胞膜，細胞質，細胞核的大小形狀也不同，所以對光的折射、反射以及吸收效果也就各不相同。吸收是影響光在生物組織內傳播的主要物理現象之一，通過吸收效應，生物組織可以將光能量轉化為其他形式的能量，比如分子的動能、其他波長的熒光輻射能量等，進而影響到組織中的細胞與分子基團，導致生物體生理狀態的改變。在本的研究結果中，對于藍光產生最大影響的原因是長時間過量的藍光輻射會導致細胞中活性氧水平快速上升，進而引發一系列的代謝過程，其部分中間產物導致了細胞凋亡，對細胞和組織造成殺傷，從而造成不可逆的損傷，體現出細胞活性的下降與形態的變化。

4 結束語

本研究通過使用紫光、藍光、紅光、白光等不同波長的LED對人體離體細胞進行相同時間的輻射，選擇細胞的活性和形態作為參數進行研究與分析，從而對人體離體細胞受藍光危害的程度做出判斷。在進行1h照射時，細胞的活性與形態均變化不明顯，可以證明，人體在受光輻射不長時間內產生的影響可以通過自身的調節而消除；而在2h照射后，藍光照射后的細胞吸光度處于最低的狀態，而其他波長的光也都產生程度不等的影響，也即長時間的光輻射均為產生細胞損傷，而藍光對細胞活性的影響最大；，通過對細胞形態的觀察也可以證明，長時間的光輻射均可以得細胞形態發生較大的變化，也同樣是藍光對細胞形態的影響最為顯著。