采用GBS-seq技術(shù)構(gòu)建甜瓜高密度遺傳圖譜

張學(xué)軍，楊文莉，張永兵，張 健，郭麗霞，楊 永，李寐華，伊鴻平,

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091;2.衢州新農(nóng)都院士工作站，浙江衢州 324022)

0 引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismelonL. )是被子植物亞門、雙子葉植物綱、葫蘆目、葫蘆科、甜瓜屬一年生蔓性草本植物，染色體2 n=2 x=24[1]。甜瓜是世界重要的水果之一，中國是世界上最大的甜瓜生產(chǎn)國，無論在甜瓜栽培種植面積還是產(chǎn)量方面都是處于世界首位[2]。甜瓜的絕大多數(shù)農(nóng)藝性狀都是由數(shù)量性狀位點(diǎn)控制的，構(gòu)建高密度遺傳圖譜對(duì)農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)解析和分子育種與改良意義重大。連鎖分析是進(jìn)行QTL定位的經(jīng)典方法，而對(duì)于連鎖分析而言，在群體和分析方法一定的情況下，其分辨率的高低很大程度上取決于遺傳圖譜的精度[3]。高密度遺傳連鎖圖譜是基因精細(xì)定位和基因克隆等研究的重要工具，是分子育種的基礎(chǔ)；借助高密度的遺傳連鎖圖譜，可以快速準(zhǔn)確定位到控制目標(biāo)性狀基因，為目標(biāo)基因克隆及功能分析奠定基礎(chǔ)；高密度遺傳圖譜還有助于提高甜瓜育種水平，加快育種進(jìn)程,構(gòu)建甜瓜高密度遺傳圖譜意義重大。【前人研究進(jìn)展】迄今為止，已經(jīng)構(gòu)建了很多關(guān)于甜瓜的遺傳圖譜。早期構(gòu)建的甜瓜遺傳圖譜利用生化標(biāo)記、形態(tài)標(biāo)記等遺傳標(biāo)記，標(biāo)記數(shù)目太少，構(gòu)建的遺傳圖譜密度低，難以應(yīng)用于甜瓜育種。Baudracco -Arnasd[4]等以Védrantais和Songwhan Charmi為親本構(gòu)建218個(gè)F2代群體，利用44個(gè)RFLP標(biāo)記、64個(gè)RAPD標(biāo)記、1個(gè)同工酶、4個(gè)抗病標(biāo)記(2個(gè)抗枯萎病基因Fom-1和Fom-2、一個(gè)抗壞死斑點(diǎn)基因nsv、一個(gè)抗蚜基因Vat)和1個(gè)形態(tài)學(xué)標(biāo)記，構(gòu)建了首個(gè)甜瓜的遺傳圖譜，共14個(gè)連鎖群，總長1 390 cM。此后，基于RFLPs、AFLPs、SSRs、RAPDs 等分子標(biāo)記技術(shù)在分子遺傳圖譜構(gòu)建上得到廣泛性的應(yīng)用(Wang等[5]1997年、Brotman等[6]2000年、Oliver等[7]2001年、Périn等[8]2002年、Danin-Poleg等[9]2002年、Silberstein等[10]2003年 、Perchepied等[11]2005年、Gonzalo等[12]2005年、Zalapa等[13]2007年、王建設(shè)等[14]2007年、Fernandez.Silva等[15]2008年、陸芳等[16]2009年、Harel-Beja等[17]2010年、Palomares-Rius等[18]2011年、張寧等[19]2014年、欒非時(shí)等[20]2016年)。隨著第二代和第三代測序技術(shù)的完善，加之生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，基因組重測序以及簡化基因組測序技術(shù)(MSG、GBS、RAD-seq 等)為甜瓜基因型鑒定和遺傳作圖帶來了方法學(xué)上的跨越式突破。基于高通量測序技術(shù)構(gòu)建的遺傳圖譜的優(yōu)勢(shì)包括通量高、圖譜飽和度高、定位精準(zhǔn)。GBS(genotyping-by -sequencing)是在第二代測序基礎(chǔ)上發(fā)展的簡化基因組測序技術(shù)，原理是利用酶切加標(biāo)簽的方法，通過二代測序獲得酶切位點(diǎn)附近基因序列信息，進(jìn)行檢測分析，最終獲得大量SNP變異信息，已經(jīng)在作物遺傳圖譜構(gòu)建上大量應(yīng)用[25]。Garcia-Mas等[21]2012年、Padma等[22]2016年、劉冠等[23]2016年、Galpaz等[24]2018年以SNP和InDel標(biāo)記為代表的新一代分子標(biāo)記構(gòu)建了甜瓜高密度遺傳圖譜，然而利用GBS技術(shù)構(gòu)建甜瓜高密度遺傳圖譜并對(duì)甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL定位的研究至今未發(fā)現(xiàn)。【本研究切入點(diǎn)】甜瓜抗霜霉病基因上一直沒有發(fā)表抗性基因緊密連鎖的SNP位點(diǎn)，無法精準(zhǔn)定位這些特異性位點(diǎn)在染色體上的位置，影響甜瓜霜霉病抗病機(jī)理的研究和抗病材料在抗病育種上應(yīng)用。研究構(gòu)建甜瓜高密度遺傳圖譜。【擬解決的關(guān)鍵問題】以甜瓜材料K7-4(高抗霜霉病)和K7-2(高感霜霉病)為親本雜交并自交構(gòu)建F2分離群體，并以F2分離群體為實(shí)驗(yàn)材料，采用GBS方法構(gòu)建文庫進(jìn)行二代測序，構(gòu)建了高密度bin map遺傳連鎖圖譜，結(jié)合苗期、生長中期和生長后期三個(gè)不同時(shí)期甜瓜霜霉病表型抗病數(shù)據(jù)，對(duì)甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL定位，為甜瓜抗霜霉病機(jī)理研究、抗病種質(zhì)資源創(chuàng)制及抗病新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

抗病資源K7-2(高抗)和感病自交系K7-4(高感霜霉病)(由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供)。甜瓜霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis(Berk.etCurt.)Rostov.]采自海南三亞地區(qū)設(shè)施栽培的甜瓜，單孢子分離后擴(kuò)繁備用。"不怕雨"購自上海永通化工有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 材料準(zhǔn)備

將兩個(gè)親本及 F2群體甜瓜種子置于恒溫烘箱中，調(diào)制溫度48～68℃，干熱梯度消毒4 d，再將消毒后的干種子用0.1%升汞消毒處理10 min，大量清水沖洗干凈后，種于海南三亞新疆農(nóng)科院農(nóng)作物育種繁育中心溫室大棚，取三葉期的幼苗葉片裝入2 mL離心管中，編號(hào)并迅速放置于冰盒，后續(xù)進(jìn)行DNA的提取。從海南三亞田間采集早期自然發(fā)病的甜瓜葉片，鏡檢鑒定確定為甜瓜霜霉病。用毛刷刷取葉背面的分生孢子，單孢子分離培養(yǎng)后，點(diǎn)接法[26]接種于'卡拉克賽'的子葉上，之后放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行黑暗交替擴(kuò)繁培養(yǎng)備用。

1.2.2 DNA的提取和文庫構(gòu)建

取上述準(zhǔn)備的嫩葉進(jìn)行液氮研磨，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltriethyl-ammnonium bromide, CTAB)法(Murray, Thompson, 1980)[27]提取所有實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，用Nanodrop檢測DNA的純度，Qubit對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。檢驗(yàn)合格的DNA樣品通過Covaris破碎機(jī)隨機(jī)打斷成長度為350bp的片段。采用Elshire 等[28](2011)報(bào)道的GBS方法構(gòu)建文庫，研究用TruSeq Library Construction Kit 試劑盒進(jìn)行建庫，嚴(yán)格按照說明書使用推薦的試劑和耗材。DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備，將檢測合格的GBS文庫及親本文庫樣品用第二代測序平臺(tái)Illumina HiSeq 2500進(jìn)行雙末150bp的測序。

1.2.3 SNP檢測

將親本K7-2和K7-4測序得到的原始測序序列raw reads進(jìn)行過濾，使用Fastqc軟件評(píng)估reads的質(zhì)量，首先去除帶接頭(adapter)的reads pair，一是單端測序read中含有的N的含量超過該條read長度比例的10%時(shí)，需要去除此對(duì)paired reads；二是單端測序read中含有的低質(zhì)量(質(zhì)量值Q ≤ 5)堿基數(shù)超過該條read長度比例的50%時(shí)，需要去除此對(duì)paired reads，最終得到Clean reads用于后續(xù)分析。利用短序列比對(duì)軟件 BWA(Li, Durbin R, 2009)[29]對(duì)每個(gè)樣本分別進(jìn)行比對(duì)分析，研究參考基因組下載地址https://melono mics. net/files/Genome/Melon_genome_v 3. 5.1 /。統(tǒng)計(jì)比對(duì)情況，利用貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點(diǎn)，采用SAM tools(Li H, Handsaker B)[30]對(duì)過濾后的bam文件進(jìn)行群體SNP的檢測。為減少測序錯(cuò)誤造成的假陽性SNP，對(duì)于兩個(gè)親本及F2群體SNP的篩選，親本與F2群體堿基的測序質(zhì)量及序列的比對(duì)質(zhì)量要求都大于20，保證SNP信息的準(zhǔn)確性；而對(duì)于兩個(gè)親本的SNP挖掘，SNP堿基支持?jǐn)?shù)不少于4。

1.2.4 高密度遺傳圖譜構(gòu)建

采用滑動(dòng)窗口(sliding window) 的方法(Chen et al., 2014; Huang et al., 2009)[31,32]，基于甜瓜親本基因型檢測結(jié)果，進(jìn)行親本間多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)。過濾掉親本信息缺失的位點(diǎn)，篩選父母本都為純合且親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)，再提取F2子代在上述獲得的親本多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的基因型，要求堿基支持?jǐn)?shù)不小于4，不大于1 000，且篩選基因型至少覆蓋所有75%以上個(gè)體的標(biāo)記。使用 ScmapV5的卡方檢驗(yàn)，對(duì)獲得標(biāo)記進(jìn)行偏分離分析，過濾偏分離p-value值小于0.001的標(biāo)記。最后根據(jù)75%的相似度[32]，將位于每個(gè)scaffold上的標(biāo)記進(jìn)行bin劃分，將SNP標(biāo)記劃分為bin標(biāo)記，使用Joinmap 4.0軟件，設(shè)置recombination frequency(0.25～0.05，步長0.05)值劃分連鎖群。對(duì)于每個(gè)連鎖群，使用Joinmap 4.0最大似然法(ML)進(jìn)行排圖，利用R/qtl軟件包(Broman et al., 2003)[33]的est.map命令構(gòu)建高密度bin標(biāo)記的遺傳圖譜，遺傳圖距的計(jì)算方法用"kosambi"函數(shù)，用perl SVG模塊繪制連鎖圖。

1.2.5 抗甜瓜霜霉病表型鑒定

雙親和F2群體在甜瓜幼苗2葉1心期用L型手持噴霧瓶將濃度為5×103個(gè)孢子/mL的分生孢子懸浮液(加入0.5‰的"不怕雨")均勻噴于植株第2片真葉背面上，直到流水為止，接種后加黑色遮陰網(wǎng)保持黑暗，控制溫度在夜間22℃，白天28℃，相對(duì)濕度95%以上，之后正常管理，接種7～10 d后調(diào)查苗期發(fā)病情況。之后用剪刀除去第二片發(fā)病真葉，再將157份F2群體試驗(yàn)材料種植于海南三亞新疆農(nóng)科院農(nóng)作物育種繁育中心試驗(yàn)基地，隨機(jī)種植，正常管理，在生長中期第9片真葉完全長大后，用L型手持噴霧瓶將濃度為5×103個(gè)孢子/mL的分生孢子懸浮液(加入0.5‰的"不怕雨")均勻噴于第9片真葉背面上，直到流水為止，接種7～10 d后調(diào)查苗期發(fā)病情況。最后，在生長后期第18片真葉完全長大后，用L型手持噴霧瓶將濃度為5×103個(gè)孢子/mL的分生孢子懸浮液(加入0.5‰的"不怕雨")均勻噴于第18片真葉背面上，直到流水為止，接種7～10 d后調(diào)查苗期發(fā)病情況。

1.2.6 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照張學(xué)軍(2016)的抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[34]。0級(jí)：無癥狀；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的1/4以下；2級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的1/4～1/2；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的1/2～2/3；4級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的2/3～3/4；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的3/4以上。 病情指數(shù)(DI)計(jì)算方法：DI=∑(每個(gè)病級(jí)的植株數(shù)×級(jí)別數(shù))/(總植株數(shù)×最高級(jí)別數(shù))×100。抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分病級(jí)數(shù)和病情指數(shù)，按病級(jí)數(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn)：高抗(HR)：0<病級(jí)數(shù)≤1； 抗病(R)：1<病級(jí)數(shù)≤2；中抗(MR)：2<病級(jí)數(shù)≤3；感病(S)：3<病級(jí)數(shù)≤4；高感(HS)：病級(jí)數(shù)>4。按病情指數(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn)：高抗(HR)：0<病情指數(shù)≤15； 抗病(R)：15<病情指數(shù)≤35；中抗(MR)：35<病情指數(shù)≤55；感病(S)：55<病情指數(shù)≤80；高感(HS)：病情指數(shù)>80。

1.2.7 QTL定位

采用win QTL cart 2.5進(jìn)行QTL檢驗(yàn)，根據(jù)復(fù)合區(qū)間作圖法(complex interval mapping, CIM)，搜索步長設(shè)定為1cM，使用R/qtl軟件包(Bro-man et al., 2003)[33]對(duì)苗期、生長中期和生長后期3個(gè)時(shí)期的甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL定位，LOD閾值設(shè)置為2.5，將最高LOD值所在位置作為QTL的位置。同時(shí)使用R命令的lm來計(jì)算每個(gè)QTL的加性效應(yīng)及其對(duì)應(yīng)的表型貢獻(xiàn)率(Song et al., 2016)[35]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序和SNP檢測

研究表明,兩個(gè)親本之間存在的SNP位點(diǎn)有1 040 169個(gè)，最終獲得雙親基因型均為純合、有多態(tài)性的高質(zhì)量SNP728266個(gè)，其中有5.9%位于基因的上游1k區(qū)段內(nèi)，3.6%位于外顯子，8.3%位于內(nèi)含子，76.5%位于基因間區(qū)域，5.7%位于基因的下游1 k區(qū)段內(nèi)。表1

表1 DM-2和DM-4之間多態(tài)性SN分布
Table 1 Distribution of polymorphism SNP between DM-2 and DM-4

類別CategorySNP數(shù)量NumberofSNPs百分率Percentage(%)上游序列Upstream429675.9外顯子Exonic262183.6內(nèi)含子Intronic604468.3下游序列Downstream415125.7基因間區(qū)域Intergenic55712376.5總數(shù)Total728266100

F2群體測序結(jié)果如下：測序總量為64 Gb，平均每個(gè)子代個(gè)體的Raw data達(dá)到411.5 Mb，Q20≥93%，Q30%≥84%，測序質(zhì)量高。同時(shí)獲得1 620 097個(gè)與雙親之一基因型相同且基因型純合的SNP，其中，SNP位點(diǎn)最多的單株有17 139個(gè)，最少的單株有1 406個(gè)，平均每個(gè)單株SNP位點(diǎn)約為10 319個(gè)。

2.2 高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

通過對(duì)F2群體測序分析得到了長度為4,823.55 cM遺傳圖譜，覆蓋12個(gè)連鎖群上。共獲得SNP標(biāo)記25 224個(gè)，有3 375個(gè)bin標(biāo)記上圖，最大gap位于第10號(hào)連鎖群上，為20.29 cM，平均遺傳距離為1.43 cM。除了第7和第10連鎖群上有較大gap外，其他標(biāo)記在圖譜上分布較為均勻。表2,圖1

表2 F2群體遺傳圖譜的特征
Table 2 Characteristics of the integrated genetic map in F2populations

連鎖群GroupBin標(biāo)記BinmarkerSNP標(biāo)記SNPmarker遺傳距離Geneticdistance(cM)平均距離Averagedistance(cM)最大距離Maxdistance(cM)LG014453321627.271.418.77LG023662626495.941.367.14LG033112153413.451.336.90LG042972203394.851.337.90LG051951652285.591.475.26LG062722103391.361.446.54LG072672106448.031.6818.11LG083092440437.091.427.36LG092541867328.581.305.67LG102491616370.001.4920.29LG112151657309.661.457.12LG121951480321.731.668.39總計(jì)Overall3375252244823.551.4320.29

注：X軸表示染色體編號(hào)，Y軸表示遺傳距離(cM)，藍(lán)色表示bin標(biāo)記

Note：The X-axis indicates the number of chromosomes，the y-axis indicates the genetic distance(cM)，blue indicates the bin marker

圖1 遺傳連鎖標(biāo)記
Fig.1 Genetic linkage map

2.3 F2群體單株抗霜霉病統(tǒng)計(jì)

苗期、生長中期和生長后期人工接種甜瓜霜霉病，分析雙親、F1、F2群體的抗病性，K7-4的病情指數(shù)為4.67，表現(xiàn)為高抗；K7-2的病情指數(shù)為100.00，表現(xiàn)為高感；F1的病情指數(shù)平均值為54.67，介于兩個(gè)親本之間，屬于中抗。F2群體抗病鑒定所得的病級(jí)數(shù)繪制頻數(shù)分布圖，F(xiàn)2群體的病情調(diào)查結(jié)果符合正態(tài)分布，K7-4抗甜瓜霜霉病性狀表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。圖4

表3 親本、F1的病情指數(shù)及F2群體的遺傳參數(shù)
Table 3 Disease index of parental lines and F1and some genetic factors in F2populations

年份Year親本ParentallinesDM-4DM-2F1F2群體F2Populations平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差SD峰度Kurtosis偏度Skewness2017年11月4.67100.0054.6756.857226.0372-0.9406-0.1704

圖2 157個(gè)F2子代三個(gè)時(shí)期病級(jí)頻率分布
Fig.2 Frequency distribution of disease grade of 157 F2offspring in three stages
表4 F2群體定位的霜霉病性狀QTL
Table 4 Downy mildew quantitative trait QTL identified in the F2population

時(shí)期Stages連鎖群LG遺傳位置Position(cM)LOD值LOD加性效應(yīng)Additive顯性效應(yīng)Dominant表型變異率R20.99置信區(qū)間的左端0.99_L(cM)0.99置信區(qū)間的右端0.99_R(cM)苗期SeedingStage5266.9115.42-0.870.810.45263.1268.95272.5116.49-0.920.770.47271.5274.65281.9112.82-0.840.700.39280.9282.4647.413.02-0.420.150.0743.652.8935.513.06-0.35-0.330.0132.239.71210.315.521.10-0.470.2410.112.4中期MiddleStage1116.313.190.210.780.04113.0119.71148.813.24-0.130.710.04147.4151.51155.613.30-0.100.730.04155.2157.01178.313.190.370.730.31176.7181.82439.613.08-0.460.330.07432.8443.65265.4123.97-1.580.900.73264.4266.45272.5126.13-1.590.950.72272.0274.65280.1121.51-1.520.950.66279.5281.560.013.07-0.37-0.430.010.01.18281.913.97-0.570.360.09272.7284.68291.713.56-0.550.360.09285.7291.9965.213.74-0.570.020.0661.769.01222.313.560.23-0.660.0620.426.1后期LateStage426.814.12-0.34-0.560.0024.730.24277.513.38-0.39-0.370.01276.8278.75265.4117.71-1.150.630.46264.4266.95273.5120.06-1.160.680.47271.7275.55280.9118.60-1.100.760.45279.3284.89121.114.16-0.530.080.07119.9124.19142.913.95-0.500.070.06141.9143.0

注：X軸表示染色體編號(hào)，Y軸表示遺傳距離(cM)，紅色、綠色和黃色的點(diǎn)分別代表苗期、中期和后期定位到的QTL位點(diǎn)

Note：The X-axis indicates the number of chromosomes，The Y-axis indicates the genetic distance(cM)The red, green and yellow dots indicates the QTL loci located at seedling stage, middle stage and late stage

圖3 F2群體霜霉病性狀QTL在遺傳圖譜上分布
Fig.3 Distributions of identified QTL for F2population downy mildew quality traits on genetic linkage map

2.4 QTL結(jié)果

研究表明,3個(gè)時(shí)期共檢測到26個(gè)QTL，分布在第1、2、4、5、6、8、9、12號(hào)染色體上，第1號(hào)染色體定位到4個(gè)QTL，第2號(hào)染色體定位到1個(gè)QTL，第4號(hào)染色體定位到2個(gè)QTL，第5號(hào)染色體定位到9個(gè)QTL，第6號(hào)染色體定位到3個(gè)QTL，第8號(hào)染色體定位到2個(gè)QTL，第9號(hào)染色體定位到4個(gè)QTL，第12號(hào)染色體定位到2個(gè)QTL。

苗期、中期、后期均關(guān)聯(lián)到第5號(hào)染色體上的QTL，其主要分布在CM3.5.1_scaffold00005這個(gè)scaffold上，且定位區(qū)間一致，物理位置為 6 831 227 ～7 830 935 bp，約1Mb的區(qū)間。在該區(qū)域內(nèi)，3個(gè)生長階段的LOD值在12.82和26.13，表型貢獻(xiàn)率在39%～73%，該區(qū)域與抗霜霉病性狀具有顯著關(guān)聯(lián)。此外，苗期、中期、后期也均定位到第9號(hào)染色體，苗期定位到CM3.5.1_scaffold00016的3 231 899～3 712 188 bp區(qū)間；中期定位到 CM3.5.1_scaffold 00016的1 233 219～2 533 270 bp區(qū)間；而后期定位到CM3.5.1_sca ffold00075的1 324 690～1 503 968 bp區(qū)間，但QTL位置差異較大。研究定位極顯著的區(qū)間為CM3.5.1_scaffold00005上的6 831 227～7 830 935 bp，約1Mb的區(qū)間范圍內(nèi)。表4,圖3

3 討 論

GBS (Genotyping-by-sequencing)技術(shù)指通過測序進(jìn)行基因分型，選取合適的限制性內(nèi)切酶結(jié)合高通量群體測序構(gòu)建SNP分子標(biāo)記，可用于分子標(biāo)記開發(fā)、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳分析、群體GWAS分析、基因定位及基因克隆等領(lǐng)域。目前應(yīng)用該方法已對(duì)玉米[36]、紫花苜蓿[37]、柑橘[38]、煙草[39]、南瓜[40]、西葫蘆[41]等植物進(jìn)行了群體SNP的檢測并用于遺傳圖譜的構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析及遺傳多樣性分析等研究。然而，GBS方法也有局限性：相對(duì)全基因組測序而言GBS測序得到的數(shù)據(jù)量相對(duì)較少，容易造成較大的基因型缺失，但是在遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位分析研究上，通過GBS方法的低深度測序得到的SNP標(biāo)記已經(jīng)能夠完全滿足要求。

GBS技術(shù)已經(jīng)在植物研究上大量應(yīng)用，但是至今為止在甜瓜上報(bào)道較少，Padma等[22](2016)通過GBS技術(shù)，生成了13 789個(gè)SNP，并將其錨定到染色體上構(gòu)建了含有7 153個(gè)位點(diǎn)的高密度遺傳圖譜，并利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genomewide association study, GWAS)和雙親作圖，發(fā)現(xiàn)了位于5條染色體上的11個(gè)SNP與甜瓜果實(shí)硬度相關(guān)。侯艷[42](2017)以MR-1和M1-15為親本獲得的BC1P1群體為材料，利用雙親基因組重測序的方法，開發(fā)了578個(gè)SNP-CAPS標(biāo)記，其中200個(gè)標(biāo)記應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建，獲得一張由12個(gè)連鎖群構(gòu)成、覆蓋基因組長度1 710.4 cM、標(biāo)記間平均距離10.46 cM的遺傳連鎖圖譜。Galpaz等[24](2018)以PI414723和Dulce為親本獲得的RIL群體為材料，對(duì)其轉(zhuǎn)錄組測序及分析，獲得2 047 cM的遺傳圖譜，并檢測到241個(gè)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的QTL位點(diǎn)。利用GBS技術(shù)定位甜瓜霜霉病相關(guān)QTL位點(diǎn)至今未見報(bào)道，研究使用Elshire等(2011)報(bào)道的GBS方法對(duì)F2分離群體構(gòu)建基因組文庫并測序，總測序量為66 Gb，平均每個(gè)子代個(gè)體的Raw data為411.5 Mb，使用滑動(dòng)窗口法進(jìn)行基因分型，進(jìn)行親本間多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)，共獲得多態(tài)性位點(diǎn)106 313個(gè)，多態(tài)性標(biāo)記92 828個(gè)，開發(fā)3 375個(gè)bin標(biāo)記，SNP標(biāo)記25 224個(gè)，遺傳總距離為4 823.55 cM，平均遺傳距離為1.43 cM，并對(duì)甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL定位，結(jié)合苗期、生長中期和生長后期的表型數(shù)據(jù)總共定位到26個(gè)QTL，特別是三個(gè)時(shí)期均關(guān)聯(lián)到5號(hào)染色體上的QTL表型變異率范圍達(dá)到39%～73%，與前期研究結(jié)果[34]相比研究中定位到的QTL更精確。通過對(duì)甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL精確定位，為甜瓜抗霜霉病后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過GBS測序技術(shù)及滑動(dòng)窗口等方法構(gòu)建甜瓜高密度遺傳連鎖圖譜，遺傳總距離為4 823.55 cM，平均遺傳距離為1.43 cM；結(jié)合苗期、生長中期和生長后期的抗病表型數(shù)據(jù)定位到與甜瓜霜霉病性狀進(jìn)行QTL定位，總共26個(gè)QTL，苗期、中期、后期均關(guān)聯(lián)到5號(hào)連鎖群上的QTL，分布在CM3.5.1_scaffold00005這個(gè)scaffold上，且定位區(qū)間一致，物理位置為6 831 227～7 830 935 bp，約1Mb的區(qū)間。