水稻OsHOX6啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)

何 丹，玉山江·麥麥提，楊 渡,韓 盛,Inez Hortense Slamet-Loedin

(1.新疆維吾爾自治區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣總站，烏魯木齊 830000；.農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；3.國(guó)際水稻研究所作物育種和生物化學(xué)系轉(zhuǎn)基因研究室， 菲律賓)

0 引 言

【研究意義】常見(jiàn)的非生物逆境脅迫環(huán)境因子包括干旱、高鹽、低溫等，制約了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，影響作物的產(chǎn)量。挖掘水稻抗逆基因并進(jìn)行功能分析及其機(jī)理研究是抗逆育種的基石，水稻的根系生長(zhǎng)發(fā)育情況與其抗旱性、抗鹽堿性、抗菌害及地上部分的生理情況關(guān)系密切。水稻根系的形態(tài)、生理特性與抗逆性有直接關(guān)系[1]。雖然對(duì)雙子葉模擬植物擬南芥的根系生長(zhǎng)發(fā)育的研究較多，可典型的單子葉植物水稻根系形成與發(fā)育控制基因相關(guān)研究則比較有限，水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與分子機(jī)理以及根系生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因 有待進(jìn)一步進(jìn)行克隆和功能研究。水稻根系形成由幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、激素以及表觀遺傳控制[2]。水稻側(cè)根是在中柱鞘細(xì)胞和內(nèi)皮層細(xì)胞部位發(fā)生的[3-4]。根的內(nèi)皮層是根的最基本組織結(jié)構(gòu)，由分生組織分化形成，由數(shù)層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，可以起到保護(hù)作用，也能控制對(duì)物質(zhì)運(yùn)輸與根生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)中心[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多數(shù)研究認(rèn)為，水稻的根系發(fā)育和較多外界因素息息相關(guān)，尤其與植物激素關(guān)系密切。早期相關(guān)研究已經(jīng)表明，諸多外界因素影響著水稻的根系發(fā)育，以植物激素尤為明顯。植物生長(zhǎng)素在水稻側(cè)根和不定根生長(zhǎng)，向性反映和維管組織細(xì)胞分化等具有關(guān)鍵作用[6]。研究認(rèn)為較低濃度的植物生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)根系生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)素高于一定濃度會(huì)抑制水稻根系生長(zhǎng)。雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)與單子葉植物水稻的根系存在明顯差異，雙子葉植物擬南芥為直根系，沒(méi)有不定根，而單子植物水稻為不定根系，具有發(fā)達(dá)的須根系。水稻的根系結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，有不同的根系類型，包括胚胎初生根、側(cè)根和冠根[7]，水稻冠根可持續(xù)分化兩種不同類型的二級(jí)根，即小側(cè)根和大側(cè)根。大側(cè)根有不定性和向地性，但大側(cè)根無(wú)向地性，通常具有確定性。水稻小側(cè)根數(shù)量較多，沒(méi)有分支，常有小側(cè)根和大側(cè)根[8]。葫蘆卜中的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子CHB1/2/3控制體細(xì)胞中胚胎發(fā)送的基因表達(dá)，CHB2參與到胚胎的早期發(fā)育過(guò)程，在成熟的番茄植物中Vahox1在次生生長(zhǎng)的韌皮部也能表達(dá)，說(shuō)明其編碼產(chǎn)物優(yōu)先參加到形成層到韌皮部組織的分化過(guò)程[9，10]。轉(zhuǎn)錄因子Oshox1 and Oshox4可能是發(fā)育抑制因子。屬于HD-ZipⅠ家族的Habh-4在初步轉(zhuǎn)基因擬南芥里過(guò)量表達(dá)時(shí)，能夠表現(xiàn)出較為明顯的抗旱性[11]。試驗(yàn)表明，過(guò)量表達(dá)的Oshox1能夠改變擬南芥葉片的形狀和大小、抑制其的生長(zhǎng)，且其抑制效應(yīng)與它的DNA結(jié)合位點(diǎn)和HD基序的上游序列有關(guān)；過(guò)量表達(dá)的Oshox4水稻能夠改變?nèi)~片、開(kāi)花期、株高等，這與在GA3的反應(yīng)中充分表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用[12]。水稻的OsHOX6、Oshox22和Oshox24與AtHB7和AtHB12基因具有一定的同源性，在進(jìn)行干旱脅迫時(shí)這些基因會(huì)進(jìn)行對(duì)應(yīng)干旱調(diào)控，但截至目前關(guān)于此類基因的抗旱功能方面未見(jiàn)報(bào)道[13，14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)水稻HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子亞家族I的部分基因功能進(jìn)行了研究，可OsHOX6基因與啟動(dòng)子的功能未見(jiàn)報(bào)道。研究在OsHOX6基因啟動(dòng)子特異性表達(dá)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究OsHOX6基因啟動(dòng)子調(diào)控GUS基因表達(dá)的模式，證實(shí)OsHOX6基因主要在根尖的頂端分生區(qū)與內(nèi)皮層表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用RT-PCR法，以HPT (潮霉素)引物與OsHOX6引物從水稻中克隆得到OsHOX6基因啟動(dòng)子，以常規(guī)品種‘IR64’作為水稻材料，含GUS雙元載體pCAMIA1302 的LBA4404根癌農(nóng)桿菌菌系用于轉(zhuǎn)基因。限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶等均由Invitrogen公司購(gòu)買，載體構(gòu)件中使用的是DH50大腸桿菌菌株。表1，圖1

表1 引物序列
Table 1 Primers sequence

上游引物Upstreamofprimer序列(5'-3')Sequence(5'-3')下游引Downstreamofprimer序列(3'-5')Sequence((3'-5')HPT-FGCCTGACCTATTGCATCTCCHPT-RAATTGCCGTCAACCAAGCTCOsHOX6-FGTGGATGATGATGGACGTTGOsHOX6-RGCGAGCTTCTCCTTCTTGAG

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3的T-DNA結(jié)構(gòu)
Fig.1 Structure of T-DNA region in plant binary vector of pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3

1.2 方 法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

將未成熟種子的外殼去掉，消毒后在超凈工作臺(tái)內(nèi)，從種子里分離出未成熟的胚并N6培養(yǎng)基上，以農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染后，在25℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，置于選擇培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)5 d，誘導(dǎo)出抗性愈傷組織放到選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，篩選出健康的綠色愈傷組織，置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d長(zhǎng)出綠色分化苗，將幼苗轉(zhuǎn)移到有生根培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)至生根，移栽至花盆鍛苗15 d后，移到溫室培養(yǎng)[15]。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻PCR鑒定

采用快速提取DNA試劑盒方法提取總DNA，根據(jù)潮霉素基因組序列與OsHOX6基因設(shè)計(jì)引物HPT-F,和HPT-R，OsHOX6-F和OsHOX6-R。表1

1.2.3 GUS組織化學(xué)染色

將轉(zhuǎn)基因水稻苗和野生型水稻苗的根、莖、葉和花器官剪下置于1.5 μL離心管中，加入Gus染色液，37℃染色4 h；取出材料，轉(zhuǎn)入75%酒精中脫色2～3次；肉眼或者顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsHOX6轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定

采用兩對(duì)特異性引物對(duì)T0代的轉(zhuǎn)基因水稻植物進(jìn)行PCR鑒定。研究表明，Hpt1和Hpt1擴(kuò)增出529 bp的目標(biāo)片段; OsHOX6特異性引物可擴(kuò)增出280 和350 bp兩條片段；使用Hpt primer進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)候，轉(zhuǎn)基因水稻的幼苗擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小一致的片段，使用OsHOX6引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中擴(kuò)增出兩條與預(yù)期大小一致的片段，而對(duì)照野生型水稻中只有一條帶。圖2，圖3

圖2 用HPT primer轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR
Fig.2 Using HPT primer confirm positive plant

圖3 用OsHOX6 primer 轉(zhuǎn)基因植株 PCR陽(yáng)性檢測(cè)陽(yáng)性檢測(cè)
Fig.3 using OsHOX6 primer confirm positive plant

2.2 Gus 基因在不同組織的特異性表達(dá)

對(duì)水稻的花粉、花藥、種皮和葉片均進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，Gus目標(biāo)基因在水稻的花粉和部分受傷處均能表達(dá)，但在水稻種皮和葉片的椰肉部分未見(jiàn)表達(dá)，目標(biāo)基因能在花藥與花粉等生殖細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)在損傷部分與葉脈中也表達(dá)。圖4

2.3 Gus 基因在根內(nèi)皮層的特異性表達(dá)

經(jīng)過(guò)染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水稻的側(cè)根能被染色，且染色均勻，OsHOX6啟動(dòng)子能夠在水稻的側(cè)根進(jìn)行特異性表達(dá)。通過(guò)對(duì)側(cè)根的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可以看出，側(cè)根維管束內(nèi)皮層均被染均勻的藍(lán)色，OsHOX6啟動(dòng)子在側(cè)根的維管束內(nèi)皮層內(nèi)能夠進(jìn)行特異性表達(dá)。圖5

3 討 論

植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子又可以分為四大亞類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，HD-Zip 家族轉(zhuǎn)錄因子亞家族I、II，基因表達(dá)干旱，高鹽，ABA和冷害等環(huán)境的誘導(dǎo)，這兩類基因參與基因信號(hào)途徑，通過(guò)與激素途徑基因與下游基因互作來(lái)調(diào)控植物細(xì)胞擴(kuò)增，分裂與分化，從而提高植物的耐逆性。HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植物特有發(fā)育進(jìn)程，其中包括細(xì)胞分化和形態(tài)建成等。在早期的研究中己經(jīng)了解到水稻的根系發(fā)育與眾多外界因素息息相關(guān)，尤其植物激素。研究表明，生長(zhǎng)素在促進(jìn)不定根、側(cè)根生長(zhǎng)、維管組織分化、向性反應(yīng)等過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。水稻HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子亞家族I的OsHOX6基因啟動(dòng)子在水稻內(nèi)皮層中特異性表達(dá)。水稻具有較為復(fù)雜和發(fā)達(dá)的根系結(jié)構(gòu)和不同的根系類型，包含胚胎初生根、冠根和側(cè)根，冠根可以繼續(xù)分化產(chǎn)生兩種類型的二級(jí)根，大側(cè)根和小側(cè)根。研究結(jié)果表明，OsHOX6基因啟動(dòng)子主要表達(dá)在側(cè)根的內(nèi)皮層，葉片葉脈、花粉與損傷的組織，弄清HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子OsHOX6基因和啟動(dòng)子在根系形成與發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面需要進(jìn)一步深入研究。OsHOX6基因啟動(dòng)子在花粉和對(duì)水稻機(jī)械損傷部位能夠表達(dá)，此啟動(dòng)子在花粉活性和昆蟲(chóng)對(duì)植物的危害機(jī)制等方面的研究上具有一定意義。同時(shí)在花粉與組織損傷部分表達(dá)，HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子OsHOX6通過(guò)調(diào)控哪些基因形成根部?jī)?nèi)皮層干細(xì)胞的、分裂和分化以及根內(nèi)皮層形成有關(guān)基因關(guān)系需進(jìn)一步深入研究。

A：Gus基因水稻花藥里的表達(dá) B：Gus基因在水稻花粉里表達(dá) C：Gus基因在損傷部分表達(dá)D：Gus基因在葉片葉脈中表達(dá)

A：Gusgene expression in rice anther B:Gusgene expression in rice pollen C:Gusgene expression in wound D:Gusgene wound expression

圖4Gus基因特異性的在水稻不同組織中表達(dá)
Fig. 4Gusgene specific expression in different tissue

A:Gus基因表達(dá)在主根 B：Gus基因在側(cè)根 C和 D ：Gus基因在根的內(nèi)皮層

A：Gusgene expression in main root B:Gusgene expression in lateral root C and D :Gusgene expression in the root endodermis

圖5Gus基因表達(dá)在冠根、側(cè)根及其內(nèi)皮層
Fig.5Gusgene expression in the main root 、lateral root and endodermis

4 結(jié) 論

IR64中的OsHOX6 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因，主要表達(dá)在水稻葉片葉脈、損傷部分、側(cè)根及根的內(nèi)皮層，在側(cè)根與根內(nèi)皮層中表達(dá)量非常強(qiáng)，在葉片葉肉與果實(shí)中未見(jiàn)表達(dá)。OsHOX6啟動(dòng)子在水稻內(nèi)皮層中特異性表達(dá)，一部分表皮細(xì)胞的外壁向外延伸形成吸管狀的根毛，根毛的對(duì)根的吸水作用極為重要，OsHOX6啟動(dòng)子在側(cè)根內(nèi)皮層特異性表達(dá)并隨著側(cè)根的細(xì)化，表達(dá)量增強(qiáng)，OsHOX6啟動(dòng)子連接到根的生長(zhǎng)有關(guān)的基因，把基因特異的表達(dá)在根內(nèi)皮層里，提高作物的吸水能力。 OsHOX6啟動(dòng)子在機(jī)械損傷時(shí)也能表達(dá)。