頭頂一顆珠提取物對(duì)D-gal所致大鼠腦衰老miR-155-3p的影響

陳顯兵,楊清煜，陳 穎，覃曉莉，趙方毓，，唐鮮娥，，王鳳杰，何一多，石思蓉

(1. 湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院病理科，2. 湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理教研室，3. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4. 恩施州中心血站，湖北 恩施 445000)

隨著人口老齡化的加劇，與衰老相關(guān)的疾病逐漸成為人類健康的大敵，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等受到廣泛的關(guān)注和重視。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)參與細(xì)胞凋亡及衰老等多種生命過(guò)程[1]，其中miR-155是一個(gè)多功能miRNA，在肺、心、腦及腎臟表達(dá)較豐富[2]，通過(guò)和靶基因Rheb(Ras homolog enriched in brain，Rheb)的3'UTR相結(jié)合，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬[3,4]。提高Rheb表達(dá)水平可以激活mTORC1(mammalian target of rapamycin C1，mTORC1)的活性，對(duì)延緩衰老具有重要作用[5]。頭頂一顆珠(TrilliumtschonoskiiMaxim，TTM)系百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖，其主要成分為延齡草苷，具有抗氧化和保護(hù)神經(jīng)損傷作用[6,7]；亦可通過(guò)上調(diào)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和其受體的表達(dá)來(lái)保護(hù)脊髓損傷[8]。為深入探討延齡草苷延緩衰老的機(jī)制，本研究采用大鼠皮下注射D-半乳糖法構(gòu)建大腦衰老模型，評(píng)估m(xù)iR-155/Rheb/mTOR信號(hào)通路中的相關(guān)基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)證實(shí)我們的假設(shè)，以期為延緩衰老相關(guān)疾病提供潛在的靶向藥。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑頭頂一顆珠提取物延齡草苷(CAS No.14144-6-0，Bellancom)購(gòu)自北京寰宇科創(chuàng)有限公司，純度大于98%。D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich有限公司。一抗mTOR, p-mTOR購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Rheb, 8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 動(dòng)物分組和處理50只SD大鼠，♂，體質(zhì)量(220±20)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，,許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。實(shí)驗(yàn)接受湖北民族大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督。隨機(jī)分為5組，每組10只。正常組，常規(guī)喂養(yǎng)；D-gal組，皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg·d-1)； TTM組，皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg·d-1)，并給予50 mg·kg·d-1、100 mg·kg·d-1和 200 mg·kg·d-1TTM灌胃，共6周，常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 行為學(xué)測(cè)試定位航行測(cè)試，在大鼠入水時(shí)采集信號(hào)，大鼠成功上臺(tái)，且在平臺(tái)上停留時(shí)間超過(guò)10 s，記錄總路程、潛伏期、平均速度等。空間探索實(shí)驗(yàn)記錄1 min內(nèi)大鼠穿越原有平臺(tái)的次數(shù)。Morris水迷宮完成24 h后，麻醉，每組選5只大鼠，先用0.9%生理鹽水經(jīng)心臟行主動(dòng)脈灌洗，并用4%中性多聚甲醛灌注固定。剩余大鼠灌流后取海馬，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HE、Nissl及8-OHdG和Rheb染色腦組織常規(guī)切片，行HE及Nissl染色，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及Nissl小體情況。

免疫熒光染色：抗原修復(fù)后用BSA 封閉，滴加8-OHdG(1 ∶250)和Rheb(1 ∶300)抗體，4 ℃ 冰箱過(guò)夜，加入二抗 (1 ∶1 000) ，DAPI 染核，Nikon 80i熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 Real-time PCR法檢測(cè) miR-155-3p水平取海馬組織，采用miRNA Purification Kit miRNA提取試劑盒(Tiangen)，提取其miRNA(具體步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行)。引物設(shè)計(jì)與合成在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.mirbase.org)和 GenBank 查找基因序列，使用軟件Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將所得引物進(jìn)行合成 (生工生物工程(上海)有限公司合成)。 miRNA-155-3p基因引物序列：CCTCCTACCTGTTAGCATTAAC。miRNA逆轉(zhuǎn)錄和real time RT-PCR選用U6 snRNA作為內(nèi)參。整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系參照miRNA Real-Time PCR Assay Kit(SuperReal PreMix Plus(SYBR GREEN))試劑說(shuō)明書進(jìn)行。miRNA的逆轉(zhuǎn)錄選用miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)，Poly(A)加尾反應(yīng)和cDNA合成反應(yīng)同步進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃，15 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火/延伸，40個(gè)循環(huán)。 標(biāo)本均作復(fù)管PCR反應(yīng)，重復(fù)3次。miRNA-155-3p表達(dá)采用2-△△Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。△Ct=Ct(miRNA)-Ct(U6)，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)-△Ct對(duì)照。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由美國(guó)安捷倫Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)自動(dòng)采集分析。

1.6 海馬組織蛋白的提取及WB檢測(cè)取海馬加入裂解液和蛋白磷酸酶抑制劑及PMSF，冰上勻漿，離心(4 ℃，12 000 r·min-1，15 min)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴轉(zhuǎn)膜，加一抗Rheb(1 ∶500)、mTOR,p-mTOR，β-actin(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1 ∶5 000)/(HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，室溫孵育4 h后TBST洗膜，LAS 4000 mini凝膠成像系統(tǒng)顯影并分析。

2 結(jié)果

2.1 TTM對(duì)D-半乳糖所致衰老大鼠學(xué)習(xí)能力的影響定位航行實(shí)驗(yàn)中，5組大鼠逃避潛伏期、路程長(zhǎng)度呈縮短趨勢(shì)(Fig 1 Ai、Fig1 Bi)；定位航行訓(xùn)練第1～2天，各組之間差異無(wú)顯著性。d5，D-gal組大鼠平均逃避潛伏期和路程長(zhǎng)度均比正常對(duì)照組和TTM組長(zhǎng)(P<0.01；P<0.05；Fig1Aii、Fig1Bii)。5組大鼠游泳速度沒(méi)有明顯差別(Fig 1 Ci，F(xiàn)ig 1 Cii)。

空間探索實(shí)驗(yàn)中，穿越平臺(tái)次數(shù)D-gal組明顯少于正常對(duì)照組和TTM組(P<0.05，F(xiàn)ig1D)，提示與正常組大鼠相比，D-gal組大鼠記憶能力有所下降，而TTM組大鼠則有明顯的改善(Fig 1E)。

Fig 1 D-gal induced spatial memory retention dysfunction in rats prevented by TTM n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05vsD-gal group

2.2 TTM對(duì)D-半乳糖所致衰老大鼠海馬結(jié)構(gòu)的影響HE染色顯示，D-gal組神經(jīng)元層次減少，排列不規(guī)則，細(xì)胞核淡染；TTM組比D-gal組改變要輕(Fig 2A)。

尼氏染色顯示D-gal組尼氏小體顆粒明顯減少，TTM組尼氏小體較模型組增多 (Fig 2B) 。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，8-OHdG主要分布于海馬神經(jīng)元突起和胞體，D-gal組熒光分布比正常組和TTM組的密集、亮度更高(Fig 2C)；D-gal組免疫熒光MOD值明顯高于正常組(P<0.01)，而TTM組低于D-gal組(P<0.05)(Fig 2D)。

2.3 TTM對(duì)D-半乳糖所致衰老大鼠海馬組織中miR-155-3P水平的影響Real-time PCR結(jié)果顯示，D-gal組miR-155-3P表達(dá)水平比正常組升高(P<0.05)。而TTM處理組的miR-155-3P表達(dá)上調(diào)得到明顯的緩解(P<0.05)(Fig 3)，提示miR-155-3P表達(dá)上調(diào)與D-gal誘導(dǎo)的老化有密切關(guān)系，TTM有抑制其表達(dá)上調(diào)的作用。

2.4 TTM上調(diào)Rheb、p70S6K的表達(dá)，抑制mTOR表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，D-gal組大鼠海馬內(nèi)Rheb、p70S6K表達(dá)下調(diào)，TTM處理可上調(diào)其表達(dá)(P<0.01，P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，D-gal處理組內(nèi)p-mTOR/mTOR水平增加(P<0.05)，而TTM處理后能夠明顯抑制D-gal所致的mTOR活化(P<0.05)(Fig 4)。

Fig 2 Effects of TTM on D-gal induced tissue structure,Nissl bodies and 8-OHdG in SD rat hippocampus

Fig 3 Effects of TTM on D-gal induced miR-155-3P in

*P<0.05vscontrol group,#P<0.05##P<0.01vsD-gal group

3 討論

腦衰老過(guò)程中引起一些行為改變，如學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知能力的下降[9]。研究發(fā)現(xiàn)D-gal會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高、抗氧化功能下降，促使腦的退行性改變[10]。因此給予D-gal注射被認(rèn)為是一種理想的腦衰老模型的構(gòu)建方法，廣泛用于衰老相關(guān)研究中[11]。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射D-半乳糖可降低大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力，而不同劑量TTM干預(yù)可改善其空間認(rèn)知功能障礙及提高定向航行能力，有一定劑量依賴性，表明TTM能有效改善衰老大鼠認(rèn)知功能障礙。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與到神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，包括神經(jīng)元生長(zhǎng)、突觸可塑性等方面均有miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[12]。其中miRNA-155廣泛參與到免疫及炎癥性疾病中，腦退行性病變的發(fā)生發(fā)展與免疫及炎癥密切相關(guān)，因而推測(cè) miRNA-155可能是其治療的靶點(diǎn)[13]。基于這些研究發(fā)現(xiàn)，我們分析了miR-155-3p在D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老大鼠模型中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖皮下注射可引起大鼠海馬組織內(nèi)miR-155-3p水平增加，而TTM干預(yù)可逆轉(zhuǎn)D-半乳糖所誘導(dǎo)的miR-155-3p水平的改變。

Rheb是 Ras同源基因，表達(dá)于各種哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是miR-155-3p的靶基因之一，可能參與調(diào)控機(jī)體自噬進(jìn)而延緩衰老[14]。研究顯示，在神經(jīng)系統(tǒng)中Rheb過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)、影響神經(jīng)元棘突形成[15]。因此，我們采用蛋白免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)海馬組織內(nèi)Rheb通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導(dǎo)可降低海馬內(nèi)Rheb和p70S6k的水平、增加mTOR磷酸化，表明衰老大鼠腦組織內(nèi)Rheb通路出現(xiàn)抑制；而不同劑量TTM干預(yù)可上調(diào)D-半乳糖誘導(dǎo)的Rheb和p70S6k水平的降低、抑制p-mTOR表達(dá)，表明TTM抗衰老作用可能與調(diào)控Rheb/mTOR/p70S6k信號(hào)通路有關(guān)。但TTM是否通過(guò)下調(diào)miR-155-3p來(lái)激活該通路發(fā)揮抗衰老作用還有待深入研究證實(shí)。

Fig 4 Effects of TTM on D-gal induced Rheb, p70S6k, mTOR in SD rat hippocampus n=5)

A:Immunofluorescence staining of Rheb, ×400; B:Western blot research showed the level of Rheb, p70S6K, mTOR; C: Results of Rheb, p70S6K, mTOR

*P<0.05,**P<0.01vs control group,#P<0.05,##P<0.01vs D-gal group

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)，TTM干預(yù)可下調(diào)D-半乳糖誘導(dǎo)的海馬內(nèi)miR-155-3p水平增加、調(diào)控Rheb/mTOR/p70S6k信號(hào)通路，改善D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠的認(rèn)知障礙，從而發(fā)揮抗衰老作用，這可能為延齡草苷干預(yù)衰老相關(guān)疾病提供一定的理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)和利用天然產(chǎn)物在促進(jìn)健康和疾病治療提供參考，但其作用機(jī)制有待深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組成員的支持與協(xié)助)