基于氣相色譜技術分析灘羊肉風味物質的研究
——飛行時間質譜聯用

馬小明12

1.甘肅農業大學動物科學技術學院 甘肅蘭州 730070 2.寧夏農林科學院動物科學研究所 寧夏銀川 750002

灘羊是寧夏自治區發展羊產業的主要羊品種之一，也是寧夏農業戰略主導產業和優質牛羊肉產業發展中的重要品種資源。寧夏回族自治區灘羊這一品種優勢明顯，品牌美譽度較高，具有形成地緣優勢農產品的基礎條件，產品市場競爭潛力較大。灘羊以寧夏自治區為中心產區，具有鮮明的地域分布特色，近年來在自治區農業特色優勢產業政策扶持下，灘羊產業提質擴量成效顯著，“鹽池灘羊”及“鹽池灘羊肉”商標品牌價值凸顯，灘羊胴體精細化分割加工工藝及產品日趨成熟，以灘羊為重要支柱的優質牛羊肉產業已成為寧夏回族自治區農業戰略主導產業。不斷發掘灘羊及灘羊肉的優勢，做精、做強寧夏羊產業，對增加農民收入、助力精準扶貧工作也具有十分重要的意義。

灘羊公羊肉質較膻，導致大多數人不喜食用。針對灘羊、羯羊肉香味美等特點，開展相關研究，以期探究灘羊公羊與羯羊差異代謝物的種類和物質，助力灘羊產業發展[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇鹽池縣農戶飼養的成年灘羊羯羊、公羊各3只，共6只組織樣本。并于早晨空腹屠宰后采集背最長肌100g，切成肉丁,分別裝入玻璃瓶中密封并貼標,然后冷凍保存,待測。

1.2 試驗方法

將樣本低溫研碎，稱取樣本2.5g于20mL頂空瓶中，再加入1μL 2-辛醇為內標；隨機順序GC-MS檢測。

1.3 實驗試劑

2-辛醇(2-Octanol)，6169-06-8，≥99.5%，TCI。

1.4 試驗儀器

氣相色譜，型號 7890A,Agilent；

質譜儀,型號5975C,Agilent；

色譜柱，型號DB-Wax(30m×250μm×0.25μm)，Agilent。

1.5 上機檢測

Agilent 7890氣相色譜-質譜聯用儀配有Agilent DB-Wax毛細管柱(30m×250μm×0.25μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，GC-MS具體分析條件如下。

萃取溫度(Incubate Temperature)，65℃；

預熱時間(Preheat Time)，20min；

萃取時間(Incubate Time)，40min；

解析時間(Desorption time)，4min；

分流模式(Front Inlet Mode)，Splitless Mode；

隔墊吹掃流速(Front Inlet Septum Purge Flow)，3mL/min；

載氣(Carrier Gas)，Helium；

色譜柱(Column)，DB-Wax(30m×250μm×0.25μm)；

柱流速(Column Flow)，1mL/min；

柱箱升溫程序(Oven Temperature Ramp)，40℃ hold on 5min, raised to 250℃ at a rate of 5℃/min, hold on 5min；

前進樣口溫度(Front Injection Temperature)，260℃；

傳輸線溫度(Transfer Line Temperature)，260℃；

離子源溫度(Ion Source Temperature)，230℃；

四級桿溫度(Quad Temperature)，150℃；

電離電壓(Electron Energy)，-70eV；

質量范圍(Mass Range)，m/z 20～500；

掃描模式(Scan Mode)，Scan；

溶劑延遲(Solvent Delay)，0min。

1.6 數據處理

使用Chroma TOF軟件(V4.3x，LECO)和NIST數據庫對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、質譜匹配等分析[2]。

2 試驗結果

本次實驗中共檢出了108個峰，詳見圖1。

3 數據分析

3.1 原始數據預處理

原始數據包含0個質控(quality control,QC)樣本和6個實驗樣本，從中提取108個Peak，為了更好地分析數據，我們對原始數據進行一系列的準備和整理(data management)。主要包括以下步驟：對單個Peak進行過濾以便能去除噪音。基于四分位數距(interquartile range)對偏離值進行過濾。對單個Peak進行過濾。只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數據。對原始數據中的缺失值進行模擬(missing value recoding)。數值模擬方法為最小值二分之一法進行填補。數據標準化處理(normalization)。利用內標(internal standard,IS)進行歸一化。經過預處理后107個Peak被保留。

3.2 主成分分析(PCA)

在獲得整理好的數據之后，我們對其進行一系列的多元變量模式識別分析，首先是主成分分析。主成分分析(principalcomponent analysis, PCA)是將一組觀測的可能相關變量，通過正交變換轉換為線性不相關變量(即主成分)的統計方法。

PCA可以揭示數據的內部結構，從而更好的解釋數據變量。代謝組數據可以被認為是一個多元數據集，能夠在一個高維數據空間坐標系中被顯現出來，那么PCA就能夠提供一幅比較低維度的圖像(二維或三維)，展示即為在包含信息最多的點上對原對象的“投影”，有效地利用少量的主成分使得數據的維度降低[2～7]。

使用SIMCA軟件(V14.1,Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden)，對數據進行對數(LOG)轉換加中心化(CTR)格式化處理，然后進行自動建模分析。PCA模型的相關參數見表1“PCA模型參數表”。

表1 PCA模型參數表

表1內各列內容解釋如下。

Model：SIMCA軟件建模的模型編號，該編號會對應到結果文件。

Type：SIMCA的模型類型，PCA-X表示對樣本建立PCA模型。

A：模型的主成分個數。

N：模型的觀測個數(此處即為樣本數)。

R X(cum)：代表模型對X變量的解釋性。

Title：該模型對應的數據對象。

全部樣本的PCA得分散點圖(score scatter plot)如圖2所示。

圖2中橫坐標PC[1]和縱坐標PC[2]分別表示排名第一和第二的主成分的得分，散點顏色和形狀表示樣本的實驗分組。樣本全部處于95%置信區間(Hotelling’s T-squared ellipse)內。樣本間的對比分析以Class2組對Class1組為例：Class2組對Class1組的PCA得分散點圖如圖3所示。

從PCA得分圖3的結果可以看出，樣本全部處于95%置信區間(Hotelling’s T-squared ellipse)內。

交叉驗證后得到的R Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q(模型的可預測性)對模型有效性進行評判；最后通過置換檢驗(permutation test)，隨機多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機Q 值，對模型有效性做進一步的檢驗。各組對比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見“OPLS-DA模型參數表”。

3.3 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

基于GC-MS的代謝組學數據具有高維(檢測出代謝物種類多)，小樣本(檢測樣本量偏少)的特性，在這些變量中既包含與分類變量相關的差異變量，也包含大量互相之間可能存在關聯的無差異變量。這導致如果我們使用PCA模型或PLS模型進行分析，由于相關變量的影響，差異變量會分散到更多的主成分上，無法進行更好的可視化和后續分析[8]。所以我們采用正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)的統計方法對結果進行分析。通過OPLS-DA分析，我們可以過濾掉代謝物中，與分類變量不相關的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別分析，從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實驗組的相關程度信息。使用SIMCA軟件(V14.1,Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden對數據進行對數(LOG)轉換加UV格式化處理，首先對第一主成分進行OPLS-DA建模分析，模型的質量用7折交叉驗證(7-fold cross validation)進行檢驗；然后用交叉驗證后得到的R Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q(模型的可預測性)對模型有效性進行評判；最后通過置換檢驗(permutation test)，隨機多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機Q值，對模型有效性做進一步的檢驗。各組對比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見表2“OPLS-DA模型參數表”。

表2 OPLS-DA模型參數表

Model：SIMCA軟件建模的模型編號，該編號會對應到結果文件。

Type：SIMCA的模型類型，OPLS-DA表示建立OPLS-DA模型。

A：模型的主成分個數。

N：模型的觀測個數(此處即為樣本數)。

R X(cum)：代表模型對X變量的解釋性。

R Y(cum)：代表模型對Y變量的解釋性。

Q (cum)：模型的可預測性。

Title：該模型對應的數據對象。

樣本間的對比分析以Class2組對Class1組為例，對OPLS-DA結果進行解釋。

3.3.1 OPLS-DA得分散點圖

Class2組對Class1組的OPLS-DA模型得分散點圖如圖4所示。

圖中橫坐標t[1]P表示第一主成分的預測主成分得分，縱坐標t[1]O表示正交主成分得分，散點形狀和顏色表示不同的實驗分組。從OPLS-DA得分圖的結果可以看出，兩組樣本區分非常顯著，樣本全部處于95%置信區間(Hotelling’s T-squaredellipse)內。

3.3.2 OPLS-DA置換檢驗

置換檢驗通過隨機改變分類變量Y的排列順序，多次(次數n=200)建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R Y和Q值，在避免檢驗模型的過擬合以及評估模型的統計顯著性上有重要作用[9]。Class2組對Class1組OPLS-DA模型的置換檢驗結果如圖5所示。

圖5中橫坐標表示置換檢驗的置換保留度(與原模型Y變量順序一致的比例，置換保留度等于1處的點即為原模型的R Y和Q值)，縱坐標表示R Y或Q的取值，綠色圓點表示置換檢驗得到的R Y值，藍色方點表示置換檢驗得到的Q值，兩條虛線分別表示R Y和Q的回歸線。原模型R Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數據的真實情況；原模型Q比較接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到比較近似的分布情況，總的來說原模型可以比較好地解釋兩組樣本之間的差異。同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q逐漸下降。說明原模型具有良好的穩健性，不存在過擬合現象。

3.4 單變量統計分析(UVA)，差異代謝物的篩選和火山圖

基于GC-MS的代謝組數據的固有特性要求我們使用多元變量統計分析方法對數據進行分析。相比與傳統的單變量統計分析方法(univariate analysis, UVA)如學生氏t檢驗、方差分析(analysis of variance, ANOVA)等更加注重代謝物水平的獨立變化，多元變量統計分析更加注重代謝物之間的關系以及它們在生物過程中的促進/拮抗關系。同時考量兩類統計分析方法的結果，有助于我們從不同角度觀察數據，得出結論，也可以幫助我們避免只使用一類統計分析方法帶來的假陽性錯誤或模型過擬合[10]。本研究使用的卡值標準為學生t檢驗(Student’s t-test)的P值(P-value)小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in the Projection, VIP)大于1。差異代謝物篩選的結果以Class2組對Class1組為例進行說明，差異代謝物篩選結果示例如下表3。

表3 差異代謝物篩選表(前7行,digits=2)

差異代謝物篩選表的主要內容包括下列內容。Id，代謝物在本數據庫中的序號；Peak，物質在Fiehn數據庫中的名稱；Similarity，該物質與質譜檢測峰的匹配度打分；VIP，來自OPLS-DA模型的VIP值；P-VALUE，來自t-test的P值；FOLD-CHANGE，兩組實驗物質定量的比值；LOG-FOLDCHANGE，FOLD CHANGE取以2為底的對數。表中Similarity打分的取值范圍為[0,1 000]，分數越高匹配度越好，依據Similarity及其他信息，我們將一些物質進行刪減和合并，并以analyte和unknown代替。我們將篩選差異代謝物的結果以火山圖(volcano plot)的形式進行可視化，Class2組對Class1組的結果如圖6所示。

火山圖中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化(取以2為底的對數)，縱坐標表示學生t檢驗的P-value(取以10為底對數的負數)，散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點越大VIP值越大。散點顏色代表最終的篩選結果，顯著上調的代謝物以紅色表示，顯著下調的代謝物以藍色表示，非顯著差異的代謝物為灰色。

4 討論

本次實驗中共檢出108個峰，經過我們對原始數據進行一系列的處理后，107個峰值被保留，經兩組樣品對比分析，我們共得到顯著上調的代謝物12種，顯著下調的代謝物2種，主要的差異代謝物有：丙酮、辛烷、2,3,4三甲基己烷、戊酸-5羥基-2,雙丁基苯基酯、鄰苯二甲酸環丁基葵旨、2,2,4,6,6-五甲基庚烷。

隨著我國經濟社會的快速發展，居民生活水平顯著提高，食品消費結構的進一步優化調整，使得畜產品越來越受到消費者的青睞，特別是以低膽固醇、高蛋白含量為代表的羊肉產品需求不斷加大，羊肉、羊肉卷等特色產品早已成為人們餐桌上的美食，特別是北方人，吃火鍋的時候少不了來一盤羊肉(卷)，這也為我國肉羊等草食性畜牧產業的繁榮發展提供了強勁的外源動力，也促使肉羊產業成為畜牧產業中迅速發展的新興產業。羊肉不僅是部分民族地區居民的重要肉類食品，其在改善我國城鄉居民膳食結構、提高國人身體素質、優化生活品質等諸多方面發揮作用。羊肉除了作為居民的重要肉類食物以外，在西北，其所帶動的養羊業同樣肩負著帶動縣域經濟的發展，增加農牧民收入，脫貧攻堅的重要抓手。

膻味物質一直是影響人們是否喜食羊肉的主要原因之一，膻味絕大多數情況下是指來自綿羊或山羊肉所散發出的使人不愉快的異味。羊肉風味中較難接受的味道分別為“mutton flavor”和“pastoral”2種風味。Watkins等研究發現，產生“mutton flavor”風味的物質目前比較確定的為支鏈脂肪酸，主要為4-甲基辛酸(4-methyl octylic acid，MOA)、4-乙基辛酸(4-ethyl octylic acid，EOA)和4-甲基壬酸(4-methyl nonyl acid，MNA)，3種支鏈脂肪酸產生“mutton flavor”的閾值分別為20、6、650μg/kg；而產生“pastoral”風味的物質主要為3-甲基吲哚(3-methylindole，MI)和4-甲基苯酚(4-methyl phenol，MP)，MI和MP產生“pastoral”風味的閾值分別為50.0、0.2 μg/kg[11]。而本研究并未檢測出這幾種物質，據報道，羊肉膻味的幾類物質主要存在與羊肉的脂肪組織中，脂肪組織是最明顯的風味物質的來源，特別是其中的4-辛烷和4-甲基九烷。某些脂溶性物質在風味和膻味形成中發揮著重要作用，但在肌肉中這類含量相對較少[12～18]。因此，本研究正好也印證了相關研究結果。

羊肉具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇等特點，是中國傳統的肉類食品，鹽池灘羊肉，因其肉質細嫩、膻味輕、味美，受到廣大消費者的喜愛，氣譜-質譜方法已普遍應用到了羊肉風味物質的研究中[19～21]，雖然影響羊肉風味的因素是多樣的，但對于闡明其主要的代謝物質對進一步提高和改善灘羊肉品質具有一定的意義，因此，因進一步開展相關研究，助推灘羊產業發展。