夏枯草不同超聲時間后熊果酸和齊墩果酸的含量變化

向潤清 黃寬 張艷嬌

摘要：目的測定并分析夏枯草不同超聲時間后其同分異構體熊果酸和齊墩果酸的含量變化。方法采用Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15），等度洗脫，檢測波長205 nm，柱溫18℃，流速為03 mL/min，測定熊果酸、齊墩果酸的含量變化。結果夏枯草中熊果酸在08～48 μg范圍內呈線性關系，相關系數達到09997;齊墩果酸在096～576 μg范圍內呈線性關系，相關系數為09995。夏枯草中的熊果酸及齊墩果酸在超聲時間為60 min時含量均最高。結論本實驗以超聲時間對夏枯草中同分異構體熊果酸和齊墩果酸含量的變化做出研究，隨著超聲時間的延長，兩者含量均逐步升高，這為夏枯草中部分五環三萜類成分的提取、分離、鑒定、制備提供一定的參考。

關鍵詞：夏枯草;熊果酸;齊墩果酸;同分異構體

中圖分類號：R9272文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2019）11-0074-04

Content Changes of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Prunella vulgaris L. after Different Ultrasonic Time

XIANG Run-qing1， HUANG Kuan1， ZHANG Yan-jiao1， FAN Yuan2

（1. School of Traditional Chinese Materia Medica， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China）

【Abstract】Objective： To determine and analyze the content changes of isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. after different ultrasonic time. Methods： Thermo Acclaim C30 （150 mm × 2.1 mm， 3 μm） was used and mobile phase was acetonitrile-0.2% aqueous acetic acid （85：15）， with isocratic elution， detection wavelength 205 nm， column temperature 18° C and flow rate 0.3 mL/min. The content changes of ursolic acid and oleanolic acid was determined. Results： The ursolic acid in Prunella vulgaris L. showed a linear relationship in the range of 0.8 to 4.8 μg， and the correlation coefficient was 0.9997. The oleanolic acid showed a linear relationship in the range of 0.96 to 5.76 μg， and the correlation coefficient was 0.9995. The content of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris was highest at 60 min. Conclusion： In this experiment， the content changes of the isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. were studied by ultrasonic time. With the prolongation of ultrasonic time， the content of both were gradually increased. The study provides a certain reference for the extraction， separation， identification and preparation of some of the five-ring triterpenoids.

【Key words】Prunella vulgaris L.， ursolic acid， oleanolic acid， isomeride

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L的干燥果穗，始載于《神農本草經》，主要分布于云南、四川、貴州、湖北、湖南等地，其中硬毛夏枯草主產于云南，且被《云南省藥品標準》收載。夏枯草味苦、辛，性寒，歸肝、膽經，具有清火、明目、消腫、散結等功效，常用于治療目珠夜痛、目赤腫痛、頭痛眩暈、癭瘤、瘰疬、乳癖、乳癰、乳房脹痛等病癥[1]。現代藥理學研究表明夏枯草具有降糖[2]、降壓[3]、抗菌消炎、免疫調節作用[4]、抗氧化作用[5]、抗腫瘤、抑制病毒生長等[6-7]多種藥理作用，對目赤腫痛、畏光流淚、目珠夜痛、頭暈目眩、瘰疬、癭瘤、乳腺癌、高血壓、淋巴結核、浸潤性肺結核、單純性甲狀腺腫、腮腺炎、急性黃疸型傳染性肝炎等多種疾病均有良好的臨床治療效果[8-9]。夏枯草中主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機酸、揮發油及糖類等成分，其中以三萜類成分為主，主要類型為齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型，以齊墩果酸和熊果酸含量最高[10]。熊果酸與齊墩果酸互為同分異構體，分子式均為C30H48O3，熊果酸分子量：45668 g/moL，齊墩果酸分子量：45671 g/moL，二者的化學結構區別在于熊果酸在19和20位碳原子上各有一個甲基，而齊墩果酸的20位碳原子上有2個甲基，在19位碳原子上無甲基。因此，兩種天然化合物的理化性質相似（兩者結構式見圖1）。

熊果酸（ursolic acid UA），又名烏索酸、烏蘇酸，以游離形式或與糖結合成苷，是夏枯草中的主要化學成分之一，熊果酸具有廣泛的生物學特性，通常用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤和保肝等[11-13]治療，如UA在HEPG2、7721和Huh7人肝癌細胞系中，可降低轉錄激活因子3（STAT3）的下游靶基因（例如Bcl-2，Bcl-xl）的表達，抑制腫瘤生長[14];齊墩果酸（Oleanolic acid OA）為齊墩果烷型五環三萜類化合物，具有保肝、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調節免疫等多種藥理作用[15-18]，如OA作用于K562細胞后，可以增加其Bax mRNA的水平，降低Bcl-xL mRNA的水平，從而調整Bcl-2家族相關凋亡蛋白表達的比例來誘導癌細胞的凋亡[19]。

本實驗根據夏枯草中五環三萜類成分同分異構體熊果酸和齊墩果酸的理化性質，應用Thermo Acclaim C30色譜柱，測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸在不同超聲時間下含量的變化。

1材料與儀器

11材料乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自默克化工技術（上海）有限公司、乙酸（分析純）、甲醇（分析純）均購自天津市風船化學試劑科技有限公司，純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），熊果酸標準品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq181217），齊墩果酸標準品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq181026），夏枯草果穗（云南羅平，批號：P20180930）。

12儀器Agilent 1200 高效液相色譜儀（VWD檢測器），FA1004N 型萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），語路超聲波清洗機、DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機（永康式速鋒工貿有限公司），T-1000 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司），D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋。

2方法與結果

21夏枯草粉末的制備干燥的夏枯草果穗，用打粉機打碎，過40目篩即得。

22熊果酸和齊墩果酸混合對照品溶液的制備精密稱定熊果酸對照品40 mg，齊墩果酸對照品48 mg置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成熊果酸和齊墩果酸濃度分別為04 mg·mL-1、048 mg·mL-1的溶液，備用。

23供試品溶液的制備精密稱取夏枯草粉末約10 g分別置于5個帶塞錐形瓶中，分別加入20 mL甲醇，密塞，超聲處理20、30、40、50、60 min后取出，放冷，搖勻，過濾，取濾液，過045 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

24色譜條件色譜柱：Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15），等度洗脫，檢測波長205 nm，柱溫18℃，流速為03 mL/min，進樣量：10 μL。

25熊果酸、齊墩果酸對照品、夏枯草供試品溶液的高效液相色譜（HPLC）圖譜分別見圖2～3（A：齊墩果酸，B：熊果酸）。

26線性關系考察

261標準曲線的繪制取“22”項下的標準對照品溶液，經045 μm的微孔濾膜過濾后，按“24”項下色譜條件分別取2、4、6、8、10、12 μl進樣，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y（mAU *s）為縱坐標，繪制標準曲線，得到熊果酸、齊墩果酸的回歸方程分別為：y=18744x-13911，R2=09997;y=y=23405x-20622，R2=09995，結果表明，熊果酸、齊墩果酸分別在08～48 μg，096～576 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，見圖4～5。

262精密度考察取“22”項下的混合對照品溶液10 μL，按“24”項下色譜條件連續進樣6次，按峰面積計算熊果酸、齊墩果酸的RSD值分別為：161%、161%，表明儀器精密度良好。

263穩定性考察取“23”項下超聲30 min的夏枯草樣品溶液，按“24”色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10 h進樣，分別計算熊果酸、齊墩果酸峰面積的RSD值為：036%、072%，夏枯草提取液在10 h內穩定。

264重復性試驗準確稱取夏枯草粉末6份，按“23”項下相同方法制得夏枯草超聲30 min的提取液，按“24”項下的色譜條件，每份進樣10 μL，以熊果酸、齊墩果酸峰面積計算，其峰面積RSD值分別為071%、084%，表明樣品重復性良好。

27夏枯草不同超聲時間后熊果酸和齊墩果酸的含量變化見表1和圖6。

3討論

31實驗結果從表1、圖6的結果中看出：在線性范圍內，熊果酸和齊墩果酸的含量均隨著超聲時間的延長而升高，熊果酸含量在20 min～40 min之間變化比較平緩，40 min～50 min之間含量變化趨勢最大，50 min～60 min之間熊果酸含量幾乎不變;齊墩果酸含量在20 min～40 min之間變化趨勢比較平緩，40 min～50 min之間含量變化趨勢較大，但沒有熊果酸的變化趨勢大，50 min～60 min之間齊墩果酸含量也幾乎不變，趨于穩定，即兩種成分含量在相同時間段內變化趨勢一致。

32色譜柱和流動相洗脫程序的選擇本實驗先后考察了Agilent ZORBAX SB-C18（46 mm×250 mm，5 μm）和Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm）色譜柱，以及流動相乙腈-乙酸水溶液（01-05%）、乙腈：磷酸水溶液（01-05%）的比例變化，最后發現用色譜柱Thermo Acclaim C30（150 mm×21 mm，3 μm），流動相為乙腈-02%乙酸水溶液（85：15）的條件下，更有利于同分異構體熊果酸和齊墩果酸兩種成分的分離。

4結論

本實驗運用RP-HPLC法測得夏枯草中同分異構體熊果酸和齊墩果酸均隨著超聲時間的延長而增加，含量變化趨勢一致，且在60 min時含量最高，以上結果提示：中藥材中同分異構體類成分的含量可能隨著超聲時間的一定延長而逐步升高，且相同時間段呈現出相同的變化趨勢。本實驗為夏枯草和其他中藥材中五環三萜類成分的提取、分離、鑒定、制備提供一定的參考。

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（收稿日期：2019-07-19）