miR-320靶向調控FoxM1對結腸癌SW480細胞增殖、侵襲的影響

董偉 戴涵斌 朱沛楓 徐永強

[摘要] 目的 分析miR-320對結腸癌SW480細胞增殖、侵襲的影響及其作用機制。 方法 將SW480細胞分為SW480組、mimic對照組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic組、pc-FoxM1組、miR-320 mimic+pc-FoxM1組;檢測各組細胞內凋亡、增殖、侵襲等相關指標。 結果 miR-320 mimic細胞表達miR-320量顯著升高（P<0.05），FoxM1表達量顯著降低（P<0.05），熒光素酶報告實驗結果顯示，與FoxM1 wt組比較，FoxM1 wt+miR-320組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）;miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞細胞增殖數及PCNA蛋白表達水平均顯著高于miR-320 mimic組（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞cleaved Caspase-9表達水平顯著降低（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比， miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞遷移率顯著升高（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞侵襲數顯著升高（P<0.05）。 結論 miR-320通過靶向調控FoxM1實現抑制結腸癌SW480細胞增殖、侵襲能力。

[關鍵詞] miR-320;FoxM1;SW480細胞;增殖;侵襲

[中圖分類號] R735.35? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）26-0033-04

[Abstract] Objective To analyze the effect of miR-320 on proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells and its mechanism. Methods SW480 cells were divided into SW480 group， mimic control group， miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-group， miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-group， miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+ group， miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+group， miR-320 mimic group， pc-FoxM1 group， miR-320 mimic+pc-FoxM1 group. The proliferation， invasion and other related indicators between groups were compared. Results The expression of miR-320 in miR-320 mimic cells was significantly increased（P<0.05）， and the expression of FoxM1 was significantly decreased（P<0.05）. The results of luciferase reporter assay showed that the luciferase activity of FoxM1 wt+miR-320 was significantly decreased compared with that of the FoxM1 wt group（P<0.05）. The cell proliferation and PCNA protein expression of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group were significantly higher than that of miR-320 mimic group（P<0.05）. Compared with that of the miR-320 mimic group， cell migration rate of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly increased（P<0.05）， and the expression level of cleaved Caspase-9 in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly lower（P<0.05）. Compared with that of the miR-320 mimic group， the number of cell invasion was significantly increased in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group（P<0.05）. Conclusion miR-320 can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells by targeting FoxM1.

[Key words] miR-320; FoxM1; SW480 cells; Proliferation; Invasion

結腸癌是目前臨床中最為常見的惡性腫瘤，也是目前死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]。有研究結果顯示，每年全球范圍內約有100萬人被確診為結腸癌，且約60萬人死于本病[2]。近年來，隨著臨床治療和診斷水平的提高和改善，在西方國家中結腸癌的死亡率雖有一定程度降低，但包括我國在內的多數發展中國家的發病率及病死率仍呈現逐年增高趨勢[3]。因而對結腸癌的臨床發病機制進行深入研究，并尋找有效及時診斷結腸癌的方案具有十分重要的意義[4]。有研究結果顯示，在腫瘤基因表達及疾病發生過程中微小RNA（miRNA，micro RNA）起到十分重要的作用[5]。有學者研究指出，miRNA異常與腫瘤細胞的轉移、增殖密切相關，并可能參與腫瘤細胞的凋亡調控，加速腫瘤進展[6]。miR-320屬于經典的抑癌基因，在多種腫瘤細胞中呈明顯異常低表達狀態[7]。但miR-320在腫瘤細胞中的調控作用機制仍未完全揭示，因而本課題通過調控SW480結腸癌細胞中miR-320表達，分析miR-320調控結腸癌SW480細胞增殖、侵襲作用機制。

1 資料與方法

1.1 細胞與試劑

SW480結腸癌細胞株購買自ATCC、DMED培養基及FBS購買自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒購買自Invitrogen公司，TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK8試劑盒、PCR熒光定量試劑盒、逆轉錄試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒及熒光素酶基因報告試劑盒購買自福麥斯生物科技有限公司，抗FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2抗體均購買自密理博生物科技有限公司，過氧化物歧化酶標記鼠抗及兔抗菌購買自北京博奧生物科技有限公司。

1.2 細胞分組及轉染

使用含有105的FBS完全培養基5 mL重懸SW480細胞，后轉移至25 cm2細胞培養瓶中，并置于5%二氧化碳的37℃恒溫培養箱中進行培養，在細胞長至80%后進行傳代培養或進行干預處理。

收集對數生長期細胞并調整細胞密度至105個/mL的濃度并將其接種于12孔板中，將其分為SW480組、mimic對照組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic組、pc-FoxM1組、miR-320 mimic+pc-FoxM1組。將細胞在培養板內繼續培養24 h，后依照轉染試劑盒說明書操作步驟對細胞進行轉染干預，其中SW480組加入空白轉染試劑，mimic對照組加入空白載體，miR-320 mimic組轉染miR-320 mimic，pc-FoxM1轉染pc-FoxM1，miR-320 mimic+pc-FoxM1組共轉染miR-320 mimic和pc-FoxM1，4 h后進行換液處理將轉染液換成正常細胞繼續培養。

1.3 方法

使用qPCR法檢測SW480組、mimic對照組、miR-320 mimic組中細胞miR-320及FoxM1表達水平，并每組檢測3個復孔取均值。使用熒光素酶報告實驗觀察miR-320的FoxM1靶向關系，使用PCR擴增miR-320與FoxM1結合片段，并將其插入熒光素酶載體中，構建FoxM1野生質粒，構建集合片段中核苷酸突變的FoxM1突變質粒，后將miR-320與FoxM1野生質粒及突變質粒共轉染如SW480細胞中并利用報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。后使用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖活性，并采用Western Blotting法檢測各組細胞內FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2蛋白水平，參照文獻[8]采用劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力。

1.4 統計學方法

使用SPSS20.0行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間數據差異采用單因素方差法進行檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-320靶向調控FoxM1表達

miR-320 mimic細胞表達miR-320量顯著升高（P<0.05），FoxM1表達量顯著降低（P<0.05），熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-320 mimic-/FoxM1wt+/FoxM1 mut-組相比，miR-320mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），且對結合位點突變后結果顯示其熒光素酶活性抑制作用消失，結果表明miR-320與FoxM1間存在靶向作用關系，見表1、2。

2.2 miR-320對SW480細胞增殖的影響

pc-FoxM1組細胞中FoxM1蛋白表達量顯著升高（P<0.05），細胞轉染4 d后miR-320 mimic組細胞增殖數及PCNA蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細胞增殖數及PCNA蛋白表達水平均顯著高于SW480組（P<0.05），miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞增殖數及PCNA蛋白表達水平均顯著高于miR-320 mimic組（P<0.05），結果提示，miR-320可通過負向調控細胞中FoxM1的表達抑制細胞增殖，見表3、4。

2.3 miR-320誘導SW480細胞凋亡

miR-320 mimic組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），pc-FoxM1組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），且miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞凋亡率顯著低于miR-320 mimic組（P<0.05）。蛋白水平檢測結果顯示，miR-320 mimic組細胞cleaved Caspase-9表達水平顯著升高（P<0.05），pc-FoxM1組顯著降低（P<0.05）;且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞cleaved Caspase-9表達水平顯著降低（P<0.05），結果提示，miR-320通過靶向調控FoxM1功能實現對SW480細胞凋亡的影響，見表5、6。

2.4 miR-320抑制SW480細胞遷移

miR-320 mimic組細胞遷移率顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細胞遷移率顯著升高（P<0.05），且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞遷移率顯著升高（P<0.05），結果提示，miR-320通過靶向FoxM1實現對SW480細胞遷移的調控，見表7。

2.5 miR-320抑制SW480細胞侵襲

miR-320 mimic組細胞侵襲數顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細胞侵襲數顯著升高（P<0.05），且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細胞侵襲數顯著升高（P<0.05），結果提示，miR-320通過靶向調控FoxM1實現對SW480細胞侵襲的影響，見表8。

3討論

結直腸癌是現階段我國臨床中較為常見的惡性腫瘤之一，其臨床發病率居高不下，有研究指出多數結腸癌患者在確診后多已發展至中晚期，但近年來隨著腸鏡在臨床中的普及，直腸癌的早期檢出率明顯提高，并有效降低患者的病死率。有學者指出，在結腸癌病灶組織中miR-320處于低表達狀態，且在癌旁的正常黏膜組織中也呈現一定程度低表達狀態[9]。結果均提示，miR-320的表達異常可能與結腸癌的發生及發展密切相關，并可作為評估患者病情的重要生物標志物之一。有研究指出，miR-320可通過調節細胞中c-Myc的表達進而有效抑制結腸癌細胞增殖活性[10]。本組研究結果顯示，miR-320 mimic轉染后SW480細胞的增殖速度明顯降低，結果提示miR-320可有效調節腫瘤細胞增殖活性。

在miRNA發揮其調控腫瘤細胞增殖及生存過程中通過調節下游蛋白表達及活性是其重要的作用機制。有研究指出，FoxM1為保守性較高的膜受體，并在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中起到十分重要的作用[11]。研究結果表明，miRNA可調節下游基因表達實現對細胞增殖的調控，進而對腫瘤的發生及發展造成不良影響[12]。miR-320低表達狀態與多種骨髓瘤和實體瘤關系密切。但miR-320調控抑制腫瘤細胞增殖調控機制尚未完全揭示。本組研究結果顯示，miR-320存在可與FoxM1結合序列，而在SW480細胞中存在明顯的異常高表達狀態，通過上調miR-320表達降低SW480細胞內FoxM1表達，結果表明miR-320可通過靶向調控FoxM1實現對腫瘤細胞進行影響。且熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-320與FoxM1存在靶向調控關系。此外，有研究指出，miR-320的上調可有效促進腫瘤細胞增殖，且減弱miR-320可有效抑制結腸癌細胞增殖[13]，結果提示miR-320可通過下調FoxM1水平而有效抑制SW480細胞增殖。

在腫瘤發展過程中細胞凋亡在其中扮演十分重要角色，miR-320可有效抑制多種腫瘤細胞凋亡，如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等。有研究結果顯示，miR-320可有效誘導結腸癌細胞凋亡，與本組研究結果相似[14]。研究顯示，在腫瘤轉移過程中，癌細胞的侵襲和遷移在其中扮演十分重要的作用，降低癌細胞的遷移和侵襲能力可抑制腫瘤轉移[15-16]。

有學者研究指出，miR-320可顯著抑制骨肉瘤、膠質瘤、乳腺癌等細胞的遷移和侵襲，并可能影響結腸癌細胞侵襲[17-18]。本研究顯示miR-320異常高表達可有效抑制SW480的侵襲和遷移，并可有效抑制MMP-2和MMP-9的表達。pc-FoxM1可有效降低SW480細胞凋亡率，且FoxM1上調表達可顯著減弱miR-320對腫瘤細胞凋亡誘導作用，結果提示miR-320可通過靶向調控FoxM1水平誘導腫瘤細胞凋亡。miR-320可顯著抑制骨肉瘤、膠質瘤、乳腺癌等細胞的遷移和侵襲，并可能影響結腸癌細胞侵襲，與本研究結果相似[19-20]。本組研究結果顯示，上調FoxM1表達可有效減弱miR-320 mimic對SW480細胞的遷移、侵襲及相關蛋白表達抑制作用，結果表明miR-320調控FoxM1表達與結腸癌SW480細胞的遷移和侵襲作用密切相關。結果表明，miR-320可有效抑制結腸癌SW480細胞遷移和侵襲，并可通過靶向抑制FoxM1實現對調控SW480的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-320通過靶向調控FoxM1實現抑制結腸癌SW480細胞增殖、侵襲能力。

[參考文獻]

[1] Sun JY，Zhao ZW，Li WM，et al. Knockdown of MALAT1 expression inhibits HUVEC proliferation by upregulation of miR-320a and downregulation of FOXM1 expression[J].Oncotarget，2017，8（37）：61499-61509.

[2] Cao S，Lin L，Xia X，et al. MicroRNA-761 promotes the sensitivity of colorectal cancer cells to 5-Fluorouracil through targeting FOXM1[J]. Oncotarget，2018，9（1）：321-331.

[3] 張明光，周海濤，梁建偉，等. 經自然腔道取標本的腹腔鏡直腸及乙狀結腸癌根治術學習曲線分析（附100例報告）[J]. 腹腔鏡外科雜志，2018，23（11）：813-818.

[4] He S，Bing L，Deng Y，et al. MiR-216b inhibits cell proliferation by targeting FOXM1 in cervical cancer cells and is associated with better prognosis[J]. Bmc Cancer， 2017，17（1）：673.

[5] Sun M，Wang X，Tu C，et al. MicroRNA-216b inhibits cell proliferation and migration in human melanoma by targeting FOXM1 in vitro and in vivo[J]. Cell Biology International， 2017，41（12）：1272.

[6] Zhang T，Ma G，Zhang Y，et al. miR-216b inhibits glioma cell migration and invasion through suppression of FoxM1[J]. Oncology Reports，2017，38（3）：1751.

[7] Hou XW，Sun X，Yu Y，et al. miR-361-5p suppresses lung cancer cell lines progression by targeting FOXM1[J].Neoplasma，2017，64（4）：526-534.

[8] 徐驛，張亦弛，王許安，等. 微RNA-490-5p抑制人肝內膽管細胞癌RBE細胞的侵襲和遷移[J]. 腫瘤，2017， 37（7）：700-709.

[9] Okato A，Arai T，Yamada Y，et al. Dual strands of pre-miR-149 inhibit cancer cell migration and invasion through targeting FOXM1 in renal cell carcinoma[J]. International Journal of Molecular Sciences，2017，18（9）：1969.

[10] Feng J，Wang X，Zhu W，et al. MicroRNA-630 suppresses epithelial-to-mesenchymal transition by regulating FoxM1 in gastric cancer cells[J]. Biochemistry，2017，82（6）：707-714.

[11] Dong GZ，Ji HJ，Lee YI，et al. Diarylheptanoids suppress proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells through modulating shh-Gli-FoxM1 pathway[J]. Archives of Pharmacal Research，2017，40（4）：509-517.

[12] Jin Y，Wang J，Han J，et al. MiR-122 inhibits epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma by targeting Snail1 and Snail2 and suppressing WNT/β-cadherin signaling pathway[J]. Experimental Cell Research，2017，360（2）：925.

[13] Zhang S，Zhou A，Bogler O，et al. Abstract 4996：The m6A hallmark of cancer：RNA demethylase ALKBH5 maintains tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells by sustaining FOXM1 expression and cell proliferation[J]. Cancer Research，2017，77（13）：4996.

[14] 余夢霞.miR-320c在急性髓系白血病中的臨床意義及其機制研究[D]. 浙江大學，2017.

[15] Han M，Xu R，Wang S，et al. Six-Transmembrane Epithelial Antigen of Prostate 3 Predicts Poor Prognosis and Promotes Glioblastoma Growth and Invasion[J]. Neoplasia，2018，20（6）：543-554.

[16] 靖培航.MicroRNA-140-5p調控ADAM10/Notch1信號通路抑制下咽癌細胞遷移和侵襲能力的研究[D]. 山東大學，2016.

[17] Li Y，Guo H，Jin C，et al. Spliceosome-associated factor CTNNBL1 promotes proliferation and invasion in ovarian cancer[J]. Experimental Cell Research，2017，357（1）：124-134.

[18] Zhang H，Lu W. LncRNA SNHG12 regulates gastric cancer progression by acting as a molecular sponge of miR 320[J]. Molecular Medicine Reports，2018，17（2）：2743.

[19] Shen H，Lu S，Dong L，et al. hsa-miR-320d and hsa-miR-582， miRNA biomarkers of aortic dissection regulate apoptosis of vascular smooth muscle cells[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology，2018，71（5）：1.

[20] 鄧希雅，唐慧，郭強. miR-320在腫瘤發生和發展中的作用及分子機制[J]. 基礎醫學與臨床，2017，37（3）：410-414.

（收稿日期：2019-05-21）