干旱脅迫下的小麥LEA蛋白組學表達模式分析

摘要：小麥是世界重要的糧食作物，利用差異蛋白質組學技術研究小麥對干旱脅迫的響應機理，有助于整體揭示小麥干旱應答的遺傳基礎。為研究干旱脅迫對小麥子粒灌漿期蛋白表達的影響，采用雙向電泳分析干旱脅迫與正常條件下成熟子粒清蛋白表達譜的差異，干旱脅迫后，小麥子粒出現130個差異蛋白質點，成功鑒定出57個差異蛋白，特異表達7個，涉及ATP-葡萄糖焦磷酸化酶、過氧化還原酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等13種蛋白質，能量類2個，病害防御相關17個，功能未知蛋白21個。

關鍵詞：小麥;干旱脅迫;蛋白組表達

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115009

我國小麥播種區大多處于干旱半干旱區，小麥基因受到激活產生干旱脅迫蛋白，維持個體存活，小麥抗旱品種抽穗期水分脅迫后產生低分子量的D-答應蛋白，與品種的抗旱性密切相關。蛋白質在植物細胞適應脅迫中起到重要作用，蛋白質作用表現為羥基自由基清除劑，細胞內酶的保護劑及降低細胞內酸度等，利用15%PEG-600高滲溶液模擬干旱脅迫條件，比較分析小麥幼苗蛋白質含量，為小麥抗旱種質資源篩選提供理論依據。

1 已有研究綜述

我國北方小麥生育期平均降水量不足2000mm，植物為生存不斷適應環境，其生理反應隨之發生系列改變，蛋白質在小麥適應干旱脅迫生命活動中具有重要的作用，探究小麥蛋白含量指標對干旱的響應程度，對選育優良抗旱性能的小麥具有實際意義。

干旱脅迫影響粒子碳水化合物的合成，影響小麥產量，春小麥生長時期遭遇干旱脅迫烘烤品質會變劣。冬小麥干旱脅迫使粒子蛋白質含量不同程度提高，但導致蛋白質產量下降。干旱促進小麥粒子清蛋白與球蛋白在灌漿初期積累，干旱嚴重時會降低蛋白質含量。有關干旱對小麥粒子總蛋白質含量的研究報道較多，針對小麥粒子蛋白質組學的研究較少[1]。

Shapiro等人在1967年發現SDS-聚丙烯酰胺凝膠電，是生物化學領域廣泛使用的易于操作的測定蛋白質相對分子量的方法，SDS電負荷量大大超過蛋白質分子電荷量，與其結合的多肽鏈帶均勻負電荷，所有SDS-蛋白復合體在電泳時以相同的Q/M值正向移動，SDS-蛋白復合體在水溶液中形狀為長橢圓棒，蛋白質分子電泳遷移率主要取決于其相對分子量。

比較蛋白譜中蛋白條帶染色深淺等，得出各組小麥蛋白的差異。蛋白質是生命活動的直接載體，小麥的根在不同環境中有明顯的變化，對小麥根部蛋白質研究有重要意義。聚乙二醇是具有滲透調節功能的生物大分子，以晉麥47號為實驗材料，對小麥3葉期幼苗進行處理，使小麥根部在缺水條件下16h后，采用尿素提取蛋白，對小麥幼苗根系蛋白質進行分析。

2 實驗研究

2.1 實驗方法

實驗以優質強筋小麥品種為材料，將小麥種子播種于40cm×50cm塑料盒中，播深3cm，株間距5cm，待開花后移入人工氣候室，生長溫度夜晚12℃，對照組土壤含水量為20%，干旱組土壤含水量為7%～12%，收取成熟粒子用于蛋白組學分析。

將收獲子粒磨成面粉，稱取50mg面粉放入1.5mL離心管，離心管置于冰上攪拌5min，取200μL上清液，加入1.2mL甲醇醋酸銨溶液，過夜沉淀蛋白質。次日4℃離心10min，加入800μL預冷丙酮，清洗沉淀，離心5min，真空離心干燥40min，室溫震蕩溶解1h，吸取上清蛋白溶液，蛋白質含量測定采用Bradford法。

用500μL上樣水化液在重泡脹IPG膠條，第1向固相PH梯度等電聚焦，等電聚焦電壓參數設置150V，1.5h，500V1.0h，線性上升到800V4500Vh。聚焦結束后將膠條轉入平衡管，平衡母液配方0.05mol/L，Tris-HCl，0.3g/ml甘油。配制后分小瓶分裝，取配好的平衡母液15mL，加入乙酰胺配置成平衡液。

向SDS-PAGE垂直板電泳，用0.5%低熔點瓊脂糖封頂，膠板置于Ettan Dalt six。連接好電泳儀與控溫循環水浴進行第2向變性膠電泳。15w/膠4h.銀染采用Plus One Silver Staining Kit方法，用固定液固定30min，用敏化液敏化30min，蒸餾水洗3遍，快速水洗膠兩面加顯色液顯色，用1.5%EDTA-Na終止反應10min，清洗干凈的膠用掃描儀掃描，于4℃保存。

用EPSON p4990掃描儀進行圖像掃描，蛋白點自動檢測，將膠與參比膠進行自動匹配。手動挖出差異蛋白點，將30mol/L鐵氟化鉀與100mol/L硫帶硫酸鈉1：1混合，蛋白點脫色完全水洗3遍終止反應。50%乙腈清洗膠塊，真空干燥膠塊20min，加入質譜級胰蛋白酶，4℃吸脹40min后用25mol/L碳酸氫銨覆蓋膠塊，冷凍干燥2h，-80℃待質譜測定。

使用AB SCIEX MALDI 5800 Analyzer進行肽指紋圖譜測定，取0.8μL酞溶液，溶于30%乙腈，混合用于質譜分析?？p圖分析軟件為GPS Explorer TM3.6.采用Mascot軟件在NCBLnr庫中進行匹配，選擇甲硫酸氧化作為可變與固定修飾。

2.2 結果分析

在粒子清蛋白與球蛋白雙向電泳圖譜中鑒定出蛋白點，第1維電泳采用24cmPH4-7的IPG膠條，通過Image Master軟件分析發現蛋白質點符合t檢測。

成功鑒定出的57個差異蛋白點，涉及13種蛋白質，28%的蛋白點參與不同生化的酶，包括球蛋白、二硫鍵異構酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑，同種蛋白酶蛋白點具有相同的等電點?？赡苡捎赗NA可變剪切引起，修飾會改變蛋白質的分子量，可能存在多個同源基因。

干旱脅迫后上調表達的蛋白質包括β-淀粉酶、過氧化還原酶、球蛋白、二硫鍵異構酶、葡萄糖與核糖醇脫氫酶。干旱脅迫后下調表達蛋白質有絲氨酸蛋白酶抑制劑，干旱脅迫后特異表達的蛋白質包括真核生活轉錄起始因子5Al與球蛋白。對照表達的蛋白點包括果糖二磷酸縮醛酶，一些同類，能量類，疾病防御相關與轉錄。功能未知蛋白有21個，代謝類有10個，蛋白質加工有6個，疾病預防相關有17個。

3 討論

在干旱脅迫下，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、果糖-1，與能量代謝有關的酶類會發生上調或下調表達。滿足細胞抗逆脅迫的物質與能量需要。β-淀粉酶可水解淀粉生成麥芽糖，具有保護蛋白質的功能。

檢測到的13個脅迫相關蛋白為絲氨酸蛋白酶抑制劑，上調表達3個，L10，L21具有相同的等電子與不同的分子量，L37，L40具有相同的分析量與不同的等電子。絲氨酸蛋白酶抑制劑在植物中含量約為3～4mg/g，普通小麥中鑒定6種不同絲氨酸蛋白酶抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制劑主要抑制絲氨酸蛋白酶類，普通小麥在高溫脅迫下，表現出絲氨酸蛋白酶抑制劑上調現象，在干旱脅迫下游10個下調表達的蛋白點鑒定為絲氨酸蛋白酶抑制劑。在多種環境下脅迫中發生差異表達。

在干旱處理中檢測到α-淀粉酶抑制劑上調表達，在硬粒小麥高溫脅迫研究中發現α淀粉酶抑制劑發生差異表達，α淀粉酶抑制劑在非生物逆境中作用不清楚。

Cor蛋白質是響應冷脅迫的蛋白質，WCOR18編碼165氨基酸的高親水蛋白質，研究表明WCOR18可能參與到多種脅迫應答中，小麥在苗期干旱脅迫下超氧化物歧化酶上調表達，在粒子發育后期能增加粒子的耐脫水性，保證種子在惡劣環境條件下不萌發。

儲藏蛋白的變化主要是球蛋白家族，干旱中有1個特異表達的蛋白點鑒定為二硫鍵異構酶，其功能是催化蛋白質檢形成二硫鍵。二硫鍵上調表達可能為修復蛋白質折疊錯誤，可能在干旱脅迫應答中扮演重要的角色。

4 結語

實驗研究干旱脅迫處理對小麥根部蛋白表達的作用，發現不同時間的干旱處理對小麥根部蛋白影響不同，實驗中遇到很多難題，經不斷改善實驗操作順利完成，實驗過程中要注意問題的嚴格把控，包括離心、研磨等，處理樣品時盡量縮短時間減少步驟，實驗采用尿素法，較直接提取法提取的蛋白量多，符合電泳樣品的標準，在蛋白提取中加1次丙酮純化蛋白，使用蛋白裂解代替傳統方法中的水，減少了誤差。制好的膠放在緩沖液中保存，使膠凝固充分，制膠與點樣時不能有氣泡。

作物干旱逆境條件下產生生理反應為多方面，不同品種小麥在同樣干旱脅迫下，抗旱性強的小麥品種干旱逆境下變化較小，研究選取的品種具有較強的抗旱性，開麥18幼苗蛋白質含量變化率較大，可能幼苗蛋白表達受到影響。干旱脅迫下與對照組品種小麥幼苗蛋白質變化顯著。金麥8號品種可作為抗旱品種利用。

參考文獻

[1] 盧云澤. 小麥灌漿期旗葉響應高溫脅迫的蛋白組學與熱響應關鍵基因HSP90的全基因組分析[D].楊凌：西北農林科技大學，2018.

作者簡介：

白建瑞（1978-），女，本科，講師。研究方向：生物學。