化肥與綠肥配施對土壤微生物多樣性的影響

閆庚戌　范丙全

摘要：通過對化肥與油菜綠肥配施的幾種不同方式所引起的微生物區系變化進行研究，為探索化肥與綠肥的最佳配施方案，建立保護土壤的農田管理規程提供理論依據。土壤樣品取自進行了6a化肥綠肥配合的定位試驗田，共進行5個施肥方案，利用Biolog技術，對施肥后土壤的微生物數量、微生物碳、無機碳、麥角固醇進行測定分析，從而得出土壤中不同菌群數量及活性的結論。發現：低量化肥與綠肥配施有利于增加土壤有機碳、微生物碳、麥角固醇以及微生物的數量;不施肥能夠提高土壤革蘭氏陰性（GN）細菌和革蘭氏陽性（GP）細菌的多樣性，有機和無機肥料都能引起土壤GN、GP細菌多樣性的下降，合理的化肥與綠肥配施，能夠減緩土壤GN細菌多樣性下降速度，油菜用作綠肥不利于GP細菌多樣性的培育;不施肥有利于土壤SFN真菌多樣性的保持，施肥會使土壤SFN真菌多樣性下降，單施化肥會導致SFP真菌多樣性的下降，綠肥和中量化肥配施能夠提高SFP真菌的多樣性。

關鍵詞：土壤;施肥;微生物多樣性

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115001

基金項目：國家自然科學基金（項目編號：30270048）;國家863項目 （項目編號：2003AA241150）;所長基金課題“農業微生物學的宏觀研究”（項目編號：2002）

*為本文通訊作者

目前，我國每年的化肥施用量在6000萬t左右，中國能以占世界7%的耕地養活占世界22%的人口，可以說化肥起到舉足輕重的作用 [1]。然而隨著化肥用量的不斷增加和不合理施用，由此引發的土壤質量問題也日益凸顯[2，3]。長期大量施用化肥會對土壤理化性狀和生物學活性等產生惡劣影響，尤其會導致土壤微生物生物量和多樣性的下降[4]。

土壤微生物可以促進土壤有機質的分解和養分轉化，是作物生長氮、磷、鉀、鎂的重要來源[5，6]。土壤微生物受農業田間管理的影響較大，作物輪作、施肥方式和秸稈還田等都會影響土壤微生物特性 [7-10]。

近年來，隨著有機肥在農業生產中的大量施用，在一定程度上減緩了化肥對土壤質量的損害。然而如果將有機肥取代化肥，又遠遠不能滿足作物的養分需求[11]。有研究指出，將化肥與有機肥配合使用，可以協調養分供應，滿足作物需求，同時減少化肥對土壤微生物活性影響[12，13]。

綠肥是最重要的有機肥之一，我國是綠肥種植最早、種植面積最大的國家 [14]。大量的科學研究表明，綠肥施用可以改善土壤理化性質，提高土壤微生物多樣性 [15]。本文利用Biolog技術，對化肥與油菜綠肥配施的5種方案引起微生物多樣性的影響進行研究，為探討綠肥與化肥配施的最佳方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品與試驗設計

1.1.1 土壤樣品

試驗時間起始于2002年9月，地址在河北省農科院院內。首先進行6a化肥綠肥配合的定位試驗。2008年5月取土樣，每小區取10鉆土樣，混勻風干備用。土壤理化性質：全氮0.093%，有機質18.3g/kg， 速效磷21.1mg/kg，堿解氮62.8mg/kg，速效鉀130mg/kg。質地為壤質褐土。

1.1.2 試驗設計

[JP2]試驗為隨機區組設計，小區面積3m2。共設5個處理：不施肥CK;單施化肥INORG-F：N180kg/hm2[JP2]、[JP3]P2O5 120kg/hm2、K2O 105kg/hm2;高量化肥與綠肥配施GM+FH：N 180kg/hm2、P2O5 105kg/hm2、K2O 105kg/hm2 + 油菜綠肥 22500 kg/hm2;低量化肥與綠肥配施GM+FL：N 111kg/hm2、P2O581kg/hm2、K2O 70.5kg/hm2+油菜綠肥 22500kg/hm2;中量化肥與綠肥配施GM+FM：N 171kg/hm2、P2O5 141kg/hm2、K2O 70.5kg /hm2+油菜綠肥22500kg/hm2。3次重復。試驗作物為小麥、玉米，播種方式一年兩作。小麥播種前翻壓綠肥。[JP]

1.2 樣品處理及分析

土壤樣品風干后過2mm 篩。其中一部分用于微生物多樣性分析，另一部分用于微生物碳、麥角固醇分析。

土壤微生物數量采用平板計數法分析。從各土壤樣品中稱30g，置于50mL離心管中并加水調至80%田間持水量，保持23℃培育2周。然后將其稱取1g稀釋至濃度10-4和10-6，分別測定真菌、細菌數量及多樣性;土壤全碳測定采用自動燃爐技術測定，無機碳測定用HCL溶解、氣相色譜，全碳減去無機碳即為有機碳含量;微生物-C測定采用熏蒸提取法[16];麥角固醇按[17]方法分析。

1.3 BIOLOG微型培養板接種

共4種培養板，分別為Biolog-GN革蘭氏陰性細菌、Biolog-GP革蘭氏陽性細菌、Biolog-SFN真菌、Biolog-SFP真菌培養板。

將稀釋后的10-6土壤溶液分別吸取150μL接入微型培養板Biolog-SFN和Biolog-SFP，將稀釋后的10-4土壤溶液，分別吸取150μL接入微型培養板Biolog-GN和Biolog-GP，于23℃下培養，用590nm波長BIOLOG讀數儀讀取3d和8d光吸光值。

1.4 數據處理與分析

采用SAS統計軟件對數據進行GLM分析。根據多樣性指數（H）計算公式、反應孔數（S）、均勻指數（E）計算公式，計算出各值。

2 結果及分析

2.1 施肥對土壤微生物量的影響

表1顯示，綠肥與低量化肥GM+FL可以增加土壤有機碳量，單施化肥會使土壤有機碳量降低;對照CK的微生物碳最低，化肥、綠肥與化肥都能夠提高微生物碳量;不施肥CK與處理GM+FM麥角固醇含量最低，施肥對麥角固醇含量影響顯著，綠肥與低量化肥GM+FL處理最高;所有處理中綠肥與低量化肥GM+FL的微生物量最多，CK最少。

說明，施肥并不減少微生物數量，加大磷肥用量減少微生物數量。低量化肥與綠肥有利于增加土壤有機碳、微生物碳、麥角固醇、微生物總量。

2.2 施肥對革蘭氏陰性細菌影響

2.2.1對革蘭氏陰性細菌多樣性和均勻度指數的影響

表2顯示，培養3d測定，不同施肥處理對反應孔數S未見顯著影響，而對多樣性指數H、均勻度指數E影響顯著，不施肥CK的多樣性指數最大，綠肥與低量化肥GM+FL次之，單純化肥、綠肥與高、中量化肥配施三者較低。均勻度指數表現與多樣性指數表現相同，不施肥CK、綠肥與低量化肥GM+FL均勻度E較高。單施化肥、綠肥與高中量化肥配施均勻度E較低;培養8d測定，95種碳源反應孔數S沒變化，多樣性指數H和均勻度指數E有所下降，處理間差異不顯著。

說明，不施肥可以提高土壤革蘭氏陰性細菌多樣性，化肥、綠肥與化肥配施會引起革蘭氏陰性細菌多樣性下降，合理的化肥綠肥配施能減緩革蘭氏陰性細菌多樣性下降。

2.2.2 對土壤革蘭氏陰性細菌利用碳源能力影響

表3顯示，培養3d測定，不同的施肥處理，對碳源利用的種類和強度相差較大。綠肥與高量化肥GM+FH能夠利用AD、CD、C、M等4種碳源，CK與單施化肥能較好地利用C、CD、A、AD 4種碳源，而綠肥與中量化肥GM+FM能利用AD、C、CD、M、P 5種碳源;培養8d的測定，處理未見明顯差異，細菌利用6種碳源的強度增加，但是利用趨勢與3d相同。而綠肥與中量化肥GM+FM對AD、C、CD、M、P等5種碳源的利用能力較強，對照CK利用6種碳源的能力都較強。

說明，不施肥能維持較高的土壤革蘭氏陰性細菌多樣性，綠肥與高量化肥配合可促進利用較多種類碳源的細菌種群的生長。

2.3 施肥對土壤革蘭氏陽性細菌的影響

2.3.1 對革蘭氏陽性細菌多樣性和均勻度指數的影響

表4顯示，培養3d測定，不同處理對反應孔數S、均勻度指數E未見顯著影響，對多樣性指數H影響顯著。不施肥CK、單施化肥處理多樣性指數較大，綠肥與低量化肥GM+FL、綠肥與高量化肥GM+FH處理較低，綠肥與中量化肥GM+FM的最大。均勻度指數E表現與多樣性指數H相同，不施肥和單施化肥均勻度指數較大，綠肥與低量化肥、綠肥與高量化肥較低，綠肥與中量化肥的最大。培養8d測定，多樣性指數H和均勻度指數E有所下降。肥料處理對反應孔數S的影響具有顯著差異，CK最大，綠肥與低量化肥GM+FL的S值最小。

說明，不施肥能保持土壤革蘭氏陽性細菌多樣性，綠肥與化肥配施、單施化肥都將導致革蘭氏陽性細菌多樣性下降。油菜綠肥不利于革蘭氏陽性細菌多樣性培養。

2.3.2 對土壤革蘭氏陽性細菌利用碳源能力影響

表5所示，培養3d測定，各處理對P類碳源利用的差異顯著，而對C、CD、A、AD、M碳源利用的影響不明顯，但利用碳源的種類和強度明顯不同。單施化肥NORG-F能利用碳源C、CD、A、AD、M，CK、綠肥與低量GM+FL能較好利用碳源AD、CD、C、M，綠肥與中量化肥GM+FM處理能夠利用碳源CD、C、M、P，綠肥與高量化肥GM+FH能夠利用6種碳源;培養8d測定，各處理對6種碳源的利用強度增加，尤其對A類碳源利用強度有顯著增強。單施化肥對A類碳源的利用顯著大于其他處理。CK能較好利用6類碳源，綠肥與低量化肥GM+FL利用AD、M碳源較好，綠肥與中量化肥GM+FM利用A、C、M等3類碳源較好，綠肥與高量化肥GM+FH利用A、C、CD碳源較好。

說明，化肥、綠肥與化肥配施會導致土壤中利用某幾種碳源的革蘭氏陽性細菌群生長，然而多樣性會下降。這一點與多樣性分析是一致的，施肥多樣性低，不施肥多樣性高。

2.4 施肥對土壤SFN真菌的影響

2.4.1 對土壤SFN真菌多樣性指數等的影響。

表6顯示，培養3d測定，單施化肥、綠肥與高量化肥GM+FH較低，綠肥與低量化肥GM+FL的S值最大，但與不施肥CK、綠肥與中量化肥GM+FM差異不明顯。單施化肥多樣性指數最小，綠肥與低量化肥GM+FL的多樣性指數H最大，不施肥CK、綠肥與高量化肥GM+FH較大。均勻度指數E也表現出與多樣性指數H相同的趨勢，綠肥與低量化肥處理均勻度較高，但與不施肥CK、綠肥與中量化肥GM+FM的均勻度差異不明顯;培養8d測定，95種碳源反應孔數S變化不明顯，多樣性指數H和均勻度指數E與3d相比略有提高。各處理間多樣性指數H 變化顯著，不施肥CK多樣性最高，單施化肥最低，CK、綠肥與低量化肥GM+FL、綠肥與中量化肥GM+FM三者間差異不顯著。

說明，不施肥有利于土壤SFN真菌多樣性保持，化肥、化肥與綠肥配施會導致土壤SFN真菌多樣性下降，綠肥與低、中量化肥配施，能維持較高的土壤SFN真菌多樣性。

2.4.2 對土壤SFN真菌利用碳源能力的影響

表7顯示，培養3d測定，土壤SFN真菌對不同碳源利用受處理影響不顯著。從趨勢看，綠肥與低量化肥GM+FL對6類碳源利用能力最高;培養8d的測定，土壤SFN真菌對6種碳源的利用強度明顯高于3d，各處理對A類碳源的利用強度影響顯著，對其他5類影響不明顯。綠肥配施中量化肥GM+FM利用A的強度最高（這可能與磷肥用量高有一定的關系），不施肥CK次之，單施化肥處理較低。綠肥與中量化肥GM+FM和CK利用6類碳源的能力都強。綠肥與高量化肥GM+FH對6類碳源的利用能力最低。

說明，綠肥與高量化肥配施不利于土壤SFN真菌多樣性培育，不施肥有利于SFN真菌多樣性培育。增加磷肥用量可能有利于SFN真菌多樣性培育，氮肥可能不利于SFN真菌多樣性培育。

2.5 施肥對土壤 SFP真菌的影響

2.5.1 對土壤SFP真菌多樣性指數等的影響

表8顯示，培養3d測定，各處理對反應孔數S、多樣性指數H影響不明顯。綠肥與高量化肥GM+FH的S值最大，CK最低;綠肥與高量化肥配合GM+FH的多樣性指數H值最高，單施化肥最低。各處理對均勻度指數E影響顯著，綠肥與低量化肥GM+FL的E值最大，但與其他處理沒有明顯差異;培養8d測定，反應孔數S沒發生變化，多樣性指數H和均勻度指數E比3d有很大提高。各處理對反應孔數S、均勻度指數E影響不顯著，但對多樣性指數H影響顯著。綠肥與中量化肥GM+FM的多樣性指數最大，單施化肥最低， CK較高，不施肥、綠肥與低量化肥、綠肥與高量化肥3者差異不顯著。

說明，綠肥與中量化肥配施能提高土壤SFP真菌多樣性，單施化肥SFP真菌多樣性會下降，不施肥維持較高的SFP真菌多樣性。增施磷肥能增加土壤SFP真菌的多樣性。

2.5.2 對土壤SFP真菌碳源利用能力的影響

表9顯示，培養3d測定，各處理對土壤SFP型真菌利用6種碳源的能力影響不顯著。從代謝強度看，各施肥處理利用碳源能力，都比不施肥CK大。不同處理利用碳源種類也存在差異，綠肥與中量化肥GM+FM利用種類多、強度大，CK、綠肥與高量化肥GM+FH處理能較好利用AD、CD、C、M碳源，綠肥與低量化肥GM+FL對6類碳源利用較高。培養8d測定，土壤SFP真菌對6種碳源利用強度明顯要高于3d，各處理對M類碳源的利用強度影響明顯，而對其它5類碳源影響不明顯。綠肥與低量化肥GM+FL利用6種碳源的能力最高，其中M達到顯著差異。

說明，綠肥與化肥配施能促進多種碳源的土壤SFP真菌生長，單施化肥引起利用各種碳源真菌群的下降，CK利用碳源種類較少，不利于SFP真菌的生長。

3 討論

[HTH][STHZ]3.1 單施化肥[HT] 與不施肥相比，土壤微生物總量的提高不明顯，卻明顯限制了土壤中細菌和真菌多樣性。劉武星等[18-20]研究發現，不施肥能夠提高土壤中革蘭氏陽性、陰性細菌多樣性，施用化學肥料能導致土壤細菌多樣性的下降，合理的化肥與綠肥配合施用能夠減緩土壤細菌多樣性的下降;這些觀點與本研究基本相符。

綠肥與化肥配施，可以明顯提高土壤微生物總量。田偉等[21]研究表明，綠肥施用能夠顯著提高土壤微生物數量。萬水霞等[22]研究證明長期施用紫云英可以提高土壤微生物總量58.09%～86.86%。佀國涵等[23]研究也認為，綠肥和化肥配施，明顯提高了土壤細菌、AM真菌及微生物總量。

[HTH][STHZ]3.2 低量化肥[HT] 與綠肥配施會導致細菌多樣性降低，但可以維持較高真菌的多樣性;高量化肥與綠肥配施有利于革蘭氏陰性細菌的多樣性，但不利于SFN真菌多樣性。孟慶杰等[24]研究表明施肥會影響土壤細菌多樣性，不施肥細菌多樣性高，化肥有機肥配施次之，單施化肥最低。Elfstrand S等[25]研究揭示，施用有機肥可以明顯促進真菌的生長。

[HTH][STHZ]3.3 氮肥不利[HT] 于真菌多樣性培育，適當增施磷肥有利于土壤真菌多樣性提高，但會導致微生物總量降低。這一點目前有分歧，如張成霞等[26]認為長期施用磷肥會增加土壤微生物量;而張彥東[27，28]等研究認為施用磷肥后，土壤微生物量增加并不明顯，磷不是影響土壤微生物的主要因素。有些研究則將化肥對土壤微生物影響傾向于均衡營養的論點，指出如果有些養分因長期得不到滿足就會成為限制因子，如長期氮處理或氮鉀處理，磷就會成為限制因子，長期磷鉀肥處理，氮可能就成為限制因子，限制因子養分豐缺程度不同，就會影響土壤微生物的數量[29]。

4 結論

低量化肥與綠肥配施有利于增加土壤有機碳、微生物碳、麥角固醇以及微生物數量。

不施肥能夠提高土壤革蘭氏陰性和陽性細菌的多樣性，使用化肥、綠肥與化肥配施都引起土壤革蘭氏陰性和陽性細菌多樣性的下降，只有合理的化肥與綠肥配施，才能夠減緩土壤革蘭氏陰性細菌多樣性下降的速度。綠肥與高量化肥配施能夠刺激和促進利用較多種類碳源的細菌種群的生長與發育。油菜作為綠肥不利于革蘭氏陽性細菌多樣性的保持與培養。

不施肥、綠肥與低、中量化肥有利于土壤SFN真菌多樣性的保持，化肥、高量化肥與綠肥配施會導致土壤SFN真菌多樣性下降。增加磷肥用量導致微生物總量下降，但有利于SFN真菌真菌多樣性提高，氮肥對SFN真菌真菌多樣性產生不良效果。

不施肥處理會使土壤SFP真菌利用碳源種類較少，不利于生長。綠肥與中量化肥能夠提高SFP真菌的多樣性，磷肥可能是SFP真菌多樣性增加的重要因素。單施化肥會引起利用各種碳源SFP真菌多樣性下降，適量綠肥與化肥配施能增加利用多種碳源的真菌生長。

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作者簡介：

閆庚戌（1970-），男，本科，高級農藝師。研究方向：蔬菜技術推廣與農產品質量安全檢驗檢測;

范丙全（1956-），男，博士生導師，研究員。研究方向：土壤微生物與農業微生物資源利用。