共焦顯微鏡觀察慢性角膜水腫患者角膜各層形態特點

蘇云娟，陳鐵紅，申海靜，陳 雪，劉冰洋，韓 旭，李 崢

0引言

角膜水腫是一種臨床癥狀，其特征是由于多余的水積聚到基質層而導致角膜厚度增加，通常繼發于角膜內皮功能下降等疾病，包括Fuchs角膜內皮營養不良(FED)晚期和手術創傷(通常與白內障手術有關)。大泡性角膜病變是慢性角膜水腫的晚期，在此階段，角膜上皮受到影響，并出現多個大小不等的水泡，稱為大泡。積聚的水可以在上皮內，也可以在上皮下，位于上皮下的可以導致基底細胞層與Bowman膜(BZ)分離。雖然對于角膜內皮功能失代償引起角膜水腫的治療方法很多，但是角膜移植仍然是大多數患者的最佳選擇[1]。目前常用的手術方式有穿透性角膜移植術(PRK)、角膜后彈力層內皮移植術(DMEK)、飛秒激光制備內皮植片的深板層角膜內皮移植術(DLEK)等[2-7]。角膜內皮移植手術目的是恢復角膜內皮的功能，功能正常的角膜內皮可以去除角膜基質層中多余的水分。有研究表明，角膜內皮移植術的臨床效果優于PRK[8-9]。PRK是將角膜基質、BZ和角膜上皮及角膜內皮全部替換。與PRK相比，角膜內皮移植術后引起的角膜不規則散光小，患者視力較好[10-11]。另外，Descemet膜去除的角膜內皮移植術(DSAEK)后角膜排斥率低于PRK[12]。角膜內皮移植術是假設通過恢復角膜內皮功能改善角膜基質水腫后角膜會變得清晰，然而，部分慢性角膜水腫的患者角膜內皮移植術后患者視力恢復不理想，角膜介質不透明被認為是導致手術失敗的原因[13]。我們關注慢性角膜水腫的臨床過程，特別是基質水腫的持續時間，試圖確定角膜內皮移植術后可能影響視力的因素。因此，觀察慢性角膜水腫引起的角膜各層變化是很重要的。共焦顯微鏡(IVCM)是一種非侵入性成像工具，用于研究各種角膜疾病中的細胞變化。在這項研究中，我們利用IVCM觀察水腫角膜的各層，確定和記錄角膜各層的具體變化，這些變化將為進一步研究奠定基礎。

圖1慢性角膜水腫患者前節照相及IVCM圖像A:前節照相;B、C:上皮層可見大泡;D:上皮細胞出現高反射的無細胞結構的片狀區域和瘢痕;E:可見上皮下神經密度顯著降低;F、G:可見BZ呈分支狀的、細的、黑線狀;H:可見前基質表現為細顆?；虼诸w粒;I:可見角膜基質細胞密度降低;J:角膜內皮正常六邊形結構消失，細胞邊界不清。

1對象和方法

1.1對象選取2017-03/2018-02到我院就診的慢性角膜水腫的患者21例21眼,其中女14例14眼，男7例7眼，年齡48～85(平均68.75±13.15) 歲，根據病史、裂隙燈和角膜厚度檢查確診為慢性角膜水腫，其中FED患者5眼和內眼手術患者16眼(白內障術后11眼，青光眼聯合白內障術后5眼)，病程2～12mo。對照組為擬行白內障手術的角膜正常的患者5例5眼，其中男4例4眼，女1例1眼，年齡56～81歲。

1.2方法所有的患者術前均進行常規的視力檢查、裂隙燈、角膜厚度及共焦顯微鏡檢查。本研究使用的共焦顯微鏡為HRT3激光IVCM，激光波長670nm，放大倍率為800倍，橫向與縱向分辨率均為1μm，觀察視野400μm×400μm角膜的面積。檢查方法：待檢眼用5g/L鹽酸丙美卡因表面麻醉3次；在顯微鏡頭的前表面滴一大滴卡波姆滴眼液，將一次性無菌角膜接觸帽蓋于物鏡上，使接觸帽內表面與物鏡表面通過凝膠相貼附。轉動角膜顯微物鏡，直到左邊的屏幕中出現明亮的激光反射，設此時焦點位置的深度為0μm。通過調整共焦鏡下頜托和前額托的位置，將受檢者的下頜與前額分別固定在下頜托與前額托上，并使受檢眼外眥與檢查標記線對齊。之后旋轉調鈕前移物鏡，在前進至靠近角膜表面時，調整物鏡位置，使掃描頭對準角膜中心，囑受檢者盡量睜大眼，前移物鏡至角膜接觸帽觸及到受檢者的角膜，通過前后及水平轉動物鏡探頭位置，以獲得不同深度和不同層次的角膜細胞和神經的圖像，共焦顯微鏡掃描角膜中央3～4mm范圍，然后移動到上、下、顳側和鼻側象限，同時踩下按鈕，將圖像進行保存。

2結果

慢性角膜水腫患者表現為視力逐漸下降，晨起時視物模糊最明顯。其中5例患者表現為有疼痛癥狀的慢性角膜水腫，其余患者無明顯的疼痛癥狀。所有患者術前最佳矯正視力為0.5～指數/眼前，角膜厚度為559～763(平均655±57)μm。裂隙燈顯微鏡觀察僅4例患者有角膜瘢痕，其余患者未見明顯角膜瘢痕。

IVCM表現：(1)所有患者上皮層均可見大泡，上皮大泡表現為黑色、圓形、邊緣清晰，位于上皮層間及上皮下。13眼(62%)中可見基底細胞層完整，偶可見上皮層與BZ分離。(2)18眼(86%)患者上皮細胞出現高反射的無細胞結構的片狀區域和瘢痕。(3)12眼(57%)患者中央區角膜上皮下未發現神經纖維，9眼(43%)患者平均中央角膜上皮下神經密度顯著降低。當水腫呈扇形時，非水腫部位可見上皮下神經，而水腫部位未見上皮下神經。(4)IVCM上所有患者BZ表現為明顯的異常，除了上述相關的瘢痕外，BZ呈分支狀的、細的、黑線狀。此外，在21眼中有13眼(62%)患者前基質表現為細顆?；虼诸w粒，且反光不同。(5)在IVCM上，全部患者角膜基質細胞密度降低。(6)全部患者角膜內皮正常的形態不能在IVCM上看到,表現為正常六邊形結構消失，細胞邊界不清。對照組IVCM表現為形態正常的角膜上皮細胞、上皮下神經纖維、BZ、基質細胞和內皮細胞，見圖1,2。

3討論

IVCM的應用可以對活體角膜進行無損傷的光學斷層掃描成像，不需要切片、固定、染色等過程就能觀察到角膜內各層細胞的形態結構和動態變化，得到類似于病理切片的圖像。近年國內有一些關于應用IVCM觀察水腫角膜的文獻報道[14-15]。本研究是應用IVCM觀察持續的角膜水腫對角膜各層的病理學影響。

圖2對照組IVCM圖像A:角膜上皮細胞;B:上皮下神經纖維;C:基質細胞;D:內皮細胞。

3.1角膜上皮的改變我們通過IVCM觀察到慢性角膜水腫的患者上皮可見大泡，表現為黑色、圓形、邊緣清晰，大多數是上皮內的，位于上皮層間。這在以往的文獻中有過報道，Alomar等[16]應用IVCM在FED晚期可以觀察到角膜上皮的改變，大泡可以被觀察到，類似大的黑環，這些發現與本研究結果一致。另外，Alomar等[16]應用IVCM發現在慢性角膜水腫患者的基底細胞層和BZ之間發現了角化細胞源性細胞(KDCs)，確切的說是位于BZ內或上皮內延伸的纖維組織間隔內，并組織學上也證實了共焦顯微鏡的觀察，并猜測這些細胞極有可能是上皮下成纖維細胞。另外，本研究發現角膜上皮細胞出現高反射的無細胞結構的片狀區域，這在以往的文獻中也曾有報道。在晚期Fuchs角膜內皮細胞營養不良患者中通常被發現上皮下高反光[16]，光學顯微鏡觀察角膜移植后切除的角膜組織證實在上皮細胞層和BZ之間有纖維結締組織的存在[17]，提示上皮下高反光為纖維結締組織，瘢痕形成。慢性角膜水腫與上皮下瘢痕形成有關[18]。Morishige等[13]報道雖然大泡性角膜病變的致病因素不會直接損傷角膜上皮，但是患者常表現為角膜上皮糜爛，這種上皮損傷可能是大泡性角膜病變角膜前部病變發展的關鍵因素，因為它導致BZ和前基質暴露在包括淚液在內的外部環境中。淚液中含有多種細胞因子和生長因子(包括β-轉化生長因子)[19]，它們促進大泡性角膜病變前部角膜的結構改變。Morishige等[13]發現有上皮糜爛病史的大泡性角膜病變患者前基質細胞成纖維化早于無此病史者。然而，上皮糜爛引起的角膜前部結構的改變是可以被預測的，因此，慢性角膜水腫角膜上皮的及時治療對角膜內皮移植術后的視力恢復是很重要[13]。

3.2角膜上皮下神經叢的改變本研究發現慢性角膜水腫的角膜上皮下神經纖維密度明顯減少或消失。之前的文獻有報道，輕度Fuchs患者角膜上皮下神經纖維密度比對照組相比顯著降低[20]；一般來說，角膜厚度增加越多，上皮下神經密度降低越大，神經總長度就越短[20]。晚期Fuchs角膜內皮細胞營養不良患者上皮下神經可能完全缺失(占病例的0～40%)[16，21]。這些研究與本研究結果相一致。另外，有研究發現，慢性角膜水腫的患者，中央角膜敏感度明顯低于年齡相仿的對照組，角膜神經表現為有異常分支的細小且稀疏的神經片段[21]。據推測，內皮細胞丟失可導致血管活性腸肽(VIP)或者其他神經肽水平下降，從而影響角膜神經密度或功能[20]。反之，角膜神經的缺失可導致包括VIP在內的神經肽水平降低，進而又導致內皮細胞凋亡[20]。

3.3角膜基質的改變本研究發現前基質細胞密度明顯減少。Hecker等[22]通過IVCM及組織學觀察發現，與正常對照組相比，需要行穿透性角膜移植的晚期FECD患者前基質細胞密度顯著降低，然而后基質細胞密度無顯著差異。引起前部基質細胞減少的確切機制尚不清楚，但是基質細胞的凋亡有可能是上皮細胞因子釋放引起的。上皮細胞因子的釋放是一種已知的上皮對機械或病毒損傷后的反應[23]。同樣，慢性角膜水腫中，上皮細胞破壞或大泡形成可導致上皮細胞因子的釋放，導致基質細胞凋亡[22]。有證據表明，FED患者角膜各層細胞均凋亡[24-25]。Li等[24]認為基質細胞對凋亡刺激高度敏感，基質細胞的變化可能先于內皮細胞和上皮細胞的變化。Szentmary等[25]在水腫角膜各層均發現凋亡細胞，提示基質細胞凋亡可能是基質細胞對任何原因引起基質水腫的反應。

3.4角膜內皮的改變本研究正常的角膜內皮細胞形態不能在IVCM上看到。這與之前的文獻報道一致。Alomar等[16]發現在光學顯微鏡下，所有FED角膜樣本中，Descemet膜(DM)均出現增厚和層疊，并伴有贅疣，內皮細胞減少；在IVCM下，所有FED患者角膜內皮細胞邊界完全模糊；在非FED患者，觀察到內皮細胞的改變，包括特征性增生和明顯的高反射核，以及細胞密度降低。

Morishige等[13]研究發現大泡性角膜病變角膜水腫持續12mo以上患者角膜膠原結構發生改變，以及角膜基質細胞向成纖維細胞轉化，角膜發生不可逆的改變；另外，這些變化可能影響DSAEK術后患者的視力。同時，他們觀察了術前基質水腫持續的時間與術后視力的關系，他們發現術前基質水腫小于12mo的患者術后視力較好，他們提出大泡性角膜病變是一種進行性疾病。

總之，大泡性角膜病變是一種臨床及病理上均進展的疾病。這一概念對于DSAEK術前慢性角膜水腫患者的治療具有重要意義，值得進一步研究。另外，不同病因引起的慢性角膜水腫的IVCM表現有何不同，目前尚無相關文獻報道，需要進一步研究。