白皮杉醇對糖尿病視網膜病變模型大鼠的治療效果及作用機制

郭 丹，杜 寧

0引言

視網膜病變是糖尿病眼病中最為嚴重的可致盲的一種并發癥，隨著糖代謝發生紊亂，會引起視網膜微血管系統損傷，最終發生血管周細胞凋亡、血管舒縮調節功能異常等視網膜病理改變[1-2]。臨床上對于糖尿病視網膜病變的治療雖然能有效對患者視網膜進行保護，但效果往往不太理想。白皮杉醇屬于白藜蘆醇的衍生物，具有較強的清除自由基、抗氧化的作用[3]。有研究表明，血管生成素-2(Ang-2)/Tie-2受體信號系統在糖尿病視網膜病變的發生和發展中有著重要的作用，且參與視網膜病變血管增殖[4]。在本實驗中，運用白皮杉醇對糖尿病視網膜病變大鼠進行干預，探究其對糖尿病視網膜病變的治療效果及作用機制。

1材料和方法

1.1材料研究動物：選擇50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。大鼠年齡為6～10(平均7.8±0.5)周齡，體質量為220～240(平均228.4±21.5)g，飼養溫度為22℃～25℃，室內濕度35%～40%，飼養室定時進行紫外線照射消毒。統一喂給標準飼料，允許自由活動，飼養時間為1wk。本研究所做實驗均獲得倫理委員會批準，符合實驗動物管理條例。

主要藥物和試劑：白皮杉醇(購自于成都曼思特生物科技有限公司)，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體(上海振譽生物科技有限公司，bsm-33411M)，Bax單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司，bsm-33279M)，血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00007422-M05)，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)單克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司，K000487P)，血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)單克隆抗體(上海莼試生物技術有限公司，CS-ELISA1280)，血管生成素-1(Ang-1)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00000283-M05)，血管生成素-2(Ang-2)單克隆抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，orb77073)，Tie-2單克隆抗體(上海滬震實業有限公司，hz126Ra21)；HE染色劑、PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組隨機選取50只健康SD大鼠中10只作為對照組，其余40只大鼠建立糖尿病視網膜病變模型。建模過程中對照組大鼠使用基礎飼料進行喂養，其余40只大鼠使用高脂高糖的飼料喂養。8wk后，所有大鼠均禁食12h，高脂高糖飼料喂養的40只大鼠腹腔注射40mg/kg的鏈脲佐菌素，對照組大鼠注射等體積的生理鹽水。3d后采取斷尾措施，采集大鼠尾部靜脈血進行血糖檢測，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖為3+,說明糖尿病模型大鼠建造成功，最終建模成功38只。所有大鼠給予基礎飼料進行喂養，自由活動4wk后，觀察大鼠眼底出現明顯的視網膜出血或者滲出、毛細血管擴張及動靜脈異常等情況，說明糖尿病視網膜病變模型大鼠建模成功，最終糖尿病視網膜病變模型建模成功35只。將建模成功的糖尿病視網膜病變大鼠隨機分為模型組8只、常規用藥組9只、低劑量白皮杉醇組9只、高劑量白皮杉醇組9只。

1.2.2藥物干預在糖尿病視網膜病變模型建模成功后，對五組大鼠進行藥物干預。常規用藥組大鼠使用依帕司他進行灌胃，劑量為100mg/kg；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠參照杜倩等[5]研究實驗中使用白皮杉醇治療青光眼大鼠的劑量分別使用劑量為100、200mg/kg的白皮杉醇行灌胃治療。對照組、模型組大鼠給予劑量為100mg/kg的生理鹽水灌胃。五組大鼠均1次/d，連續給藥4wk。

1.2.3樣本采集在對大鼠干預4wk后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，取大鼠視網膜組織，左眼視網膜組織使用4%多聚甲醛固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3μm的組織切片，行后續病理學觀察。右眼視網膜組織，在液氮冰凍保存。

1.2.4病理學觀察對五組大鼠切片樣本進行染色處理，使用二甲苯進行常規脫蠟處理2次，每次5min，然后在梯度乙醇下水化處理3min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸-乙醇分化處理30s，在0.2%氨水中返藍處理2min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10min，自來水沖洗1次；使用梯度乙醇進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

1.2.5 Western blot檢測五組大鼠視網膜組織中Bax、Bcl-2蛋白的表達取液氮中保存的視網膜組織，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規蛋白提取，BCA測定蛋白濃度。取20μg/孔蛋白質，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，轉膜結束之后，將電轉膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環境下的搖床上封閉1.5h；與一抗結合，加入TBST稀釋一抗(1∶1000)，在4℃的環境下孵育24h；之后TBST緩沖液清洗處理，與二抗結合在室溫下孵育1h，使用TBST緩沖液反復清洗，Tubulin為內參照。加入顯影劑將其浸在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗法檢測五組大鼠視網膜組織VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平采用酶聯免疫吸附試驗，將采集到的標本，取包被液(pH9.5 0.05mol/L CB)適當稀釋的抗VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2 0.1mL，添加至聚苯乙烯反應板孔中，加蓋后溫度4℃24h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH7.4, 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1mL，同時加入陽性和陰性的對照標本，在43℃置60min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2的酶標抗體0.1mL，43℃置60min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個孔中加入底物液(0.1mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8g/L)5.14mL,0.05mol/L枸櫞酸(10.5g/L)4.86mL混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4mg，置棕色小瓶中,臨用時加30% H2O2,混勻，置黑20min，在各孔中加入2mol/L H2SO40.05mL，終止反應。在酶標儀上讀取A405吸收值。分析VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平。

圖1五組大鼠視網膜病理組織學觀察圖HE染色(×400)A:對照組; B:模型組;C:常規用藥組;D:低劑量白皮杉醇組;E:高劑量白皮杉醇組。

組別BaxBcl-2對照組2.40±0.560.18±0.02模型組0.35±0.05a1.26±0.36a常規用藥組0.76±0.04a,c1.12±0.07a,c低劑量白皮杉醇組1.01±0.21a,c,e0.96±0.21a,c,e高劑量白皮杉醇組1.76±0.05a,c,e,g0.37±0.06a,c,e,g F5.11014.208P<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

組別VEGF(ng/mL)HIF-1α(pg/mL)ANGⅡ(ng/mL)對照組107.28±10.250.30±0.026.57±1.12模型組170.53±15.24a0.65±0.26a9.10±1.98a常規用藥組146.25±12.15a,c0.50±0.05a,c8.78±1.56a,c低劑量白皮杉醇組140.25±8.10a,c,e0.42±0.02a,c,e8.12±0.09a,c,e高劑量白皮杉醇組121.89±5.45a,c,e,g0.38±0.01a,c,e,g7.58±0.10a,c,e,gF5.71716.2344.032P<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

2結果

2.1五組大鼠視網膜病理組織學觀察如圖1所示，對五組大鼠視網膜病理組織圖進行觀察?？梢妼φ战M大鼠視網膜表面光滑，內、外核層細胞排列緊密、整齊；模型組大鼠視網膜內界出現明顯水腫，內外核層細胞排列不整齊，可見較多的血管內皮細胞突觸內界膜；常規用藥組大鼠視網膜內界水腫有所減輕，但仍出現內外核層細胞排列不整齊，仍有較多的血管內皮細胞突觸內界膜；低劑量白皮杉醇組大鼠視網膜內界膜水腫明顯減輕，且血管內皮細胞突觸內界膜情況得到改善；高劑量白皮杉醇組大鼠僅出現內核層細胞較排列疏松，血管未見明顯異常。

2.2五組大鼠視網膜組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較如表1所示，模型組、常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Bax表達量均低于對照組，Bcl-2蛋白表達量均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.001)；常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Bax表達量均高于模型組，Bcl-2蛋白表達量均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Bax表達量均高于常規用藥組，Bcl-2蛋白表達量均低于常規用藥組，差異均有統計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Bax表達量高于低劑量白皮杉醇組，Bcl-2蛋白表達量低于低劑量白皮杉醇組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3五組大鼠視網膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平比較如表2所示，模型組、常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于常規用藥組，差異均有統計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于低劑量白皮杉醇組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4五組大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平及Ang-1/Ang-2比值比較如表3所示，模型組、常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均高于對照組，Ang-1/Ang-2比值低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；常規用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于模型組，Ang-1/Ang-2比值高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于常規用藥組，Ang-1/Ang-2比值高于常規用藥組，差異均有統計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于低劑量白皮杉醇組，Ang-1/Ang-2比值高于低劑量白皮杉醇組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

組別Ang-1(μg/L)Ang-2(μg/L)Tie-2(μg/L)Ang-1/Ang-2對照組7.56±0.982.16±0.122.78±0.233.98±0.56模型組11.59±1.59a6.12±1.00a4.29±0.78a1.70±0.10a常規用藥組10.12±0.98a,c5.26±0.67a,c3.99±0.67a,c2.10±0.31a,c低劑量白皮杉醇組9.10±0.46a,c,e4.12±0.23a,c,e3.46±0.15a,c,e2.98±0.02a,c,e高劑量白皮杉醇組8.56±0.04a,c,e,g3.24±0.25a,c,e,g3.00±0.04a,c,e,g3.16±0.09a,c,e,g F9.93218.7608.77816.958P<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

3討論

糖尿病視網膜病變早期沒有明顯的癥狀，對視力的影響不明顯，但隨著病情的加重，其視網膜病變會累及黃斑，導致眼底出血、黃斑水腫、眼底血管閉塞等情況的發生，嚴重影響著糖尿病視網膜病變患者的視力，甚至導致患者失明[6-7]。目前常規西藥治療糖尿病視網膜病變的效果并不理想，因此本研究為尋找有效治療糖尿病視網膜病變的藥物，建立糖尿病視網膜病變模型大鼠，使用白皮杉醇對其干預，探究其治療效果及作用機制。

白皮杉醇是主要存在于大黃、甘蔗、葡萄中的一種多酚化合物，有研究表明，白皮杉醇不僅具有抗氧化、清除自由基的作用，還具有抗炎、抗菌、保護心、腦、血管及提高機體免疫力的作用[8-9]。在本研究中，對糖尿病視網膜病變模型大鼠進行干預，結果顯示，白皮杉醇能夠有效保護其視網膜，改善炎癥反應，且呈現劑量依賴，高劑量的白皮杉醇改善糖尿病視網膜病變的程度高于低劑量白皮杉醇。

糖尿病視網膜病變均伴隨著神經損傷，其在高血糖、應激反應谷氨酰胺代謝障礙有著重要的意義[10]。本研究發現糖尿病視網膜病變大鼠視網膜組織中VEGF、Bax、Bcl-2水平存在異常表達，與劉舒靜等[11]、謝安明等[12]、宋麗君等[13]、董白霞等[14]研究認為糖尿病視網膜病變患者視網膜損傷與VEGF、Bax、Bcl-2水平表達異常有關的結果一致，對糖尿病視網膜病變模型大鼠使用藥物干預后，VEGF、Bax、Bcl-2水平表達異常情況顯著改善，但使用白皮杉醇干預的大鼠VEGF、Bax、Bcl-2水平表達改善程度高于常規藥物干預的大鼠，且劑量越高改善越明顯，此結果說明高劑量的白皮杉醇通過改善VEGF、Bax、Bcl-2水平表達的異常表達而對視網膜進行保護。此結果與張會嶺等[15]研究中認為藥物干預后通過改善大鼠Bax、Bcl-2異常表達起到保護視網膜的作用研究一致。

另外有研究顯示，HIF-1α、ANGⅡ參與糖尿病視網膜病變的發生、發展[16-17]。在本研究中，對五組大鼠視網膜組織中HIF-1α、ANGⅡ表達水平進行檢測，結果顯示，糖尿病視網膜病變大鼠其HIF-1α、ANGⅡ表達水平顯著高于對照組大鼠，使用藥物進行干預后，高劑量白皮杉醇組大鼠視網膜組織中HIF-1α、ANGⅡ的表達水平顯著降低，說明高劑量白皮杉醇干預能夠有效抑制HIF-1α、ANGⅡ的異常表達，進而抑制炎性反應。

糖尿病視網膜病變后期患者會出現視網膜脫離，Ang/Tie受體信號系統參與其發展。Ang-2可同時拮抗Ang-1和促進血管內皮結構的穩定，從而對血管基底膜進行限制[18-19]。本研究結果顯示糖尿病視網膜病變大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2出現異常的表達，張冬花[20]在其研究中認為糖尿病視網膜病變患者視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均顯著高于對照組。本研究進一步觀察對糖尿病視網膜病變大鼠藥物干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平，結果顯示，高劑量白皮杉醇能夠有效改善大鼠視網膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達，可能是由于高劑量白皮杉醇通過作用于Ang/Tie受體信號通路而抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達，從而起到抑制氧化應激損傷及新生血管的生成。

綜上所述，白皮杉醇能夠有效保護糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜組織，通過作用于Ang/Tie受體信號通路，抑制炎性因子VEGF、HIF-1α、ANGⅡ的異常表達，抑制氧化應激損傷、新生血管的生成，且呈劑量依賴，高劑量效果更加顯著，為臨床上治療糖尿病視網膜病變提供了理論依據。