橙皮苷對翼狀胬肉成纖維細胞增殖及cyclin D表達的影響

劉琳琳，吳 晶，王 輝，劉錦榮，吳維霖，唐愛東，蔣貽平，胡成全

0引言

翼狀胬肉是結膜纖維血管組織異常增生侵犯角膜的一種眼表疾病，其發病人群主要集中于常年在戶外工作者[1]。現有研究表明，胬肉的發病機制涉及基因表達、凋亡機制及細胞分子生物學等[2]。角膜緣干細胞的高增殖對結膜上皮具有抑制作用，若角膜緣干細胞發生損害，則人翼狀胬肉成纖維細胞(human pterygium fibroblasts，HPF)增殖與凋亡平衡機制將會被打破而導致異常增生[3-4]。調查顯示，正常情況下，翼狀胬肉術后復發率為19.4%～75%，術后給予絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)治療后，復發率降為10.3%[5]。MMC可通過抑制DNA的合成以抑制HPF的增殖[6]，從而抑制翼狀胬肉的復發，但使用MMC的患者容易引起角膜溶解、鞏膜溶解及干眼等并發癥[7]。

圖1倒置相差顯微鏡下觀察翼狀胬肉HPF細胞A：原代細胞(×40)；B：第一代細胞(×200)；C：第二代細胞(×100)；D：第三代細胞(×100)。

有研究表明，橙皮苷可通過阻斷細胞周期從而抑制癌細胞的增殖[8]，周期蛋白D(cyclin D)主要在細胞G1期早期產生，到G1期晚期時達到高峰，在與CDK4/CDK6結合后進入細胞核，形成cyclin D-CDK4/CDK6復合體使Rb蛋白、P107蛋白及P130蛋白磷酸化，解除對E2F等轉錄因子的抑制作用，啟動細胞基因轉錄，從而啟動細胞周期[9]。本研究就橙皮苷對翼狀胬肉HPF細胞的增殖抑制作用及cyclin D蛋白表達的影響進行探討。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本取材選取原發性翼狀胬肉患者30例30眼，其中男15例，女15例，年齡30～60歲。納入標準：(1)符合原發性翼狀胬肉的診斷標準；(2)胬肉頭端侵入角膜上皮約2.5～3.5mm。排除標準：(1)復發及假性翼狀胬肉；(2)翼狀胬肉伴其他結膜疾病；(3)既往有眼部手術；(4)有活動性眼部炎癥性病變。本研究通過倫理委員會審查。所有患者均于手術室無菌條件下取胬肉組織進行原代及傳代培養，術前均與患者簽訂手術知情同意書。

1.1.2主要試劑和設備1640基礎培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，抗青-鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)，免疫熒光試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、cyclin D蛋白抗體、β-actin蛋白抗體、鼠源波形蛋白抗體(vimentin mouse monoclonal antibody)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，MTT檢測試劑盒、DMSO、酶標儀、橙皮苷(成都德瑞克公司)，細胞周期檢測試劑盒(美國BD Pharmingen公司)，MMC針劑(北京百奧萊博科技有限公司)；共聚焦顯微鏡(美國蔡司 880)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS IX71)，電泳儀、凝膠數字成像系統(英國Biorad公司)。

1.2方法

1.2.1原代細胞培養無菌條件下取原發性翼狀胬肉組織置于冰上，PBS緩沖液沖洗2～3次，將組織中血細胞盡量沖洗盡，再將胬肉組織剪碎成大小約0.5mm×0.5mm×0.5mm。接種于斜口培養瓶中，組織塊之間間隔0.5cm，加入含12%胎牛血清的1640培養基至剛好沒過組織塊，2～3d后可見長梭形細胞從組織塊邊緣爬出，約1wk后可長滿培養瓶，胰酶消化后接種于培養瓶中，每2d換1次液，以后每4～6d可傳代一次，取第三代細胞進行實驗(圖1)。

1.2.2細胞鑒別將直徑為1.5cm無菌圓形玻片置于6孔板底部，取對數期細胞接種于6孔板中，每孔2mL，接種密度為1×104個/mL。待細胞長滿圓形玻片后用PBS緩沖液輕柔沖洗玻片，將細胞爬片放入-20℃冰甲醇固定5min，PBST(0.1% Tween20/PBS)清洗2次，加入500μL blocking buffer(2% BSA、0.1% Tween20/PBS)室溫搖勻靜置30min，再用鼠源波形蛋白抗體試劑盒及免疫熒光試劑盒-抗小鼠FITC對細胞進行染色，在共聚焦顯微鏡下以492nm波長進行激發，用4，6-聯脒-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對細胞核進行染色，以358nm波長進行激發。著染細胞為扁平紡錘形或星形，核呈規則的卵圓形，則符合HPF的形態學特征。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數期生長細胞接種于96孔板中，接種密度為3×104個/mL，每孔加入細胞懸液100μL，每板均設空白對照組、無處理細胞對照組、不同濃度MMC組(1.5、7.5、30.0μmol/L)、不同濃度橙皮苷組(24、48、64、72、96、120μmol/L)；每個組設5個復孔。待細胞貼壁后更換含12%胎牛血清的1640培養基培養12h，分別加入各組濃度藥物培養于24、48、72h，每孔加入20μL MTT溶液再培養4h后將混合液吸盡，每孔再加入150μL DMSO，避光低速震蕩10min后酶標儀570nm波長檢測光密度(OD)值。計算細胞增殖抑制率，篩選橙皮苷和MMC作用濃度和時間。細胞增殖抑制率=[1-(加藥組OD值-空白對照組OD值)/(無處理細胞對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%。

1.2.4 Western blot法檢測cyclin D的表達將對數期生長細胞接種于60cm培養皿中，接種密度為5×104個/mL，每皿加入4mL細胞懸液，設空白對照組(正常培養)、MMC組(7.5μmol/L)、橙皮苷組(48、72μmol/L)，待細胞貼壁后更換含12%胎牛血清的1640培養基培養24h，加入各組濃度藥物培養48h后吸盡培養液，3mL預冷PBS緩沖液清洗2次，加入細胞裂解液(RIPA)200μL和苯甲基磺酰氟(PMSF)2μL，搖勻置于冰上30min，細胞刮收裂解液，4℃下1 200r/min離心5min，取上清分裝至0.5mL離心管中。BSA法測蛋白濃度，每孔上樣202μg蛋白總量，80V電泳2h，200mA轉膜70min，脫脂奶粉封閉抗體1h，4℃孵育一抗(稀釋比例1∶200)過夜，常溫孵育二抗(稀釋比例1∶1000)1h，加入顯影劑放入凝膠數字成像系統曝光成像。

圖2免疫熒光染色法鑒定翼狀胬肉HPF細胞(×630)A：翼狀胬肉HPF細胞呈波形蛋白陽性表達；B：細胞核DAPI染色呈陽性表達；C：細胞骨架和核染共同顯色。

濃度(μmol/L)作用時間(h)244872249.91±1.3131.78±4.3414.51±3.434817.80±1.8745.58±2.4920.81±3.096433.62±13.3151.82±0.7127.24±1.357235.03±4.7369.44±2.7451.70±1.099639.98±1.5578.31±0.6764.00±4.9912044.87±1.1481.83±0.5767.09±0.62

注：F濃度=220.192，P濃度=0.002；F時間=94.648，P時間=0.005；F濃度×時間=9.835，P濃度×時間=0.062。

濃度(μmol/L)作用時間(h)2448721.512.85±1.7139.55±1.3354.71±3.597.526.35±2.7272.57±3.2384.45±1.3530.048.70±1.8384.82±0.8690.04±0.90

注：F濃度=317.660，P濃度<0.001；F時間=1173.218，P時間<0.001；F濃度×時間=192.491，P濃度×時間=0.001。

2結果

2.1細胞鑒別波形蛋白為細胞的骨架蛋白，免疫熒光染色結果顯示，鼠源波形蛋白抗體對人翼狀胬肉HPF細胞波形蛋白染色呈陽性，共聚焦顯微鏡下呈綠色，細胞呈紡錘形、長梭形或星形扁平狀結構；DAPI可穿透細胞膜與細胞核中DNA雙鏈結合，共聚焦顯微鏡下呈藍色卵圓形，符合HPF細胞形態結構(圖2)。

2.2橙皮苷對翼狀胬肉HPF細胞增殖的抑制MTT檢測結果顯示，橙皮苷對翼狀胬肉HPF細胞的增殖抑制率隨橙皮苷作用濃度的增加而升高，隨橙皮苷作用時間的延長先升高后降低，但橙皮苷作用濃度與時間之間無交互效應(表1)。MMC對翼狀胬肉HPF細胞的增殖抑制率隨MMC濃度增加而升高，隨MMC作用時間的延長逐漸增加，且MMC作用濃度與時間之間存在交互效應(表2)。通過橙皮苷和MMC對細胞增殖抑制率的檢測結果進行初篩，后續實驗根據藥物的半抑制率(IC50)選擇藥物干預劑量，橙皮苷濃度為48、72μmol/L，MMC濃度為7.5μmol/L，作用時間選擇48h。

圖3Western blot法檢測橙皮苷對cyclin D表達的影響。

2.3橙皮苷對翼狀胬肉HPF細胞cyclin D表達的影響Western blot檢測結果顯示(圖3)，空白對照組、MMC組(7.5μmol/L)、橙皮苷組(48、72μmol/L)細胞cyclin D蛋白相對表達量分別為1.20±0.02、0.60±0.03、0.54±0.02、0.45±0.07，差異有統計學意義(F=73.025，P=0.001)，MMC組和橙皮苷組(48、72μmol/L)細胞cyclin D蛋白相對表達量均低于空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，MMC組和橙皮苷組(48、72μmol/L)細胞cyclin D蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

翼狀胬肉是一種眼表疾病，發病率高，主要癥狀為球結膜組織增生，侵及角膜，朝其中央生長，頭部多為三角狀，常現于鼻側，偶有位于顳側。不但給患者帶來容貌的困擾，若增生的球結膜將瞳孔覆蓋，則明顯影響視力，嚴重者可致盲[10]。翼狀胬肉的主要發病機制尚無定論，但近年研究表明，紫外線等多種致病因素在翼狀胬肉的形成過程中發揮著重要作用。有研究發現，翼狀胬肉的發病機制類似于腫瘤，其表皮細胞活性十分高，增殖速度快[11]。陳祎祎等[12]觀察翼狀胬肉復發與病理組織變化的關系發現，復發的胬肉病理組織變化多以細胞增生為主。目前，翼狀胬肉治療仍然主張以手術為主，藥物及其他治療為輔的聯合療法。傳統手術切除的復發率相當高，國外報道的復發率為24%～89%[13]，國內報道的為20%～70%[14]。為了抑制翼狀胬肉復發，很多學者進行了相關研究。在手術治療方面，有學者提出羊膜移植、自體角膜緣聯合干細胞結膜移植等改良方法[15]；在藥物治療方面，聯合激素或抗代謝藥物(如MMC)進行輔助藥物治療，雖然有效降低了翼狀胬肉的術后復發率，但是改良手術對正常的眼表組織有一定的損傷，抗代謝藥物對眼表的毒性作用較強，容易引起角結膜上皮修復不良及角膜鞏膜溶解等嚴重并發癥，并不能完全抑制胬肉的復發。臨床上較常用的抗代謝藥物MMC可有效抑制細胞DNA的增殖及復制等，同時具有殺傷作用[16]。因此，在翼狀胬肉手術過程中使用MMC可通過其藥理特征清理殘留的胬肉組織，顯著降低翼狀胬肉術后復發率。但其對眼表的毒性作用較強，且持續時間較長，需要引起重視。此外，史偉云等[10]認為翼狀胬肉術后并發癥與MMC誘發局部細胞凋亡及鞏膜和角鞏膜緣缺血有密切的關系。因此，尋找一種既能抑制翼狀胬肉增生復發，又對眼表組織無毒副作用的藥物至關重要。

橙皮苷(hesperidin)是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物。橙皮苷是柑橘果肉和果皮的重要成分，其含量可達柑桔幼果鮮重的1.4%[17]。贛南臍橙產量富足，因此可作為獲取橙皮苷的主要原料。因橙皮苷在植物中分布較為廣泛，其藥理活性的研究一直得到人們的廣泛關注，且在中藥新藥的創制和研發中，橙皮苷常常被選為指標成分而用于定性和定量研究。橙皮苷提取物天然無毒，具有抗氧化、抗炎、抑制前列腺素合成、抗癌變、對藥物代謝酶進行調節、抗腫瘤等多種生物活性[18-19]。目前，橙皮苷抗腫瘤活性已受到廣泛關注，其能抑制多種癌細胞的增殖分化。羅曉婷等[20]研究贛南臍橙果皮提取物橙皮苷對人低分化鼻咽癌上皮細胞株細胞增殖與細胞周期的影響發現，橙皮苷能抑制細胞的分裂增殖，誘導細胞周期特異性的細胞凋亡。已有研究表明，橙皮苷通過阻滯TGF-β/Smad信號通路抑制細胞增殖[21]，而橙皮苷對正常的機體組織無明顯毒副作用。

目前，關于橙皮苷在眼科的應用較少有研究報道。本研究通過觀察橙皮苷對體外培養的人翼狀胬肉HPF細胞增殖及cyclin D表達的影響，以期尋找輔助治療及預防翼狀胬肉復發的中醫中藥方法。本研究發現，隨著時間和濃度的增加，橙皮苷對翼狀胬肉HPF細胞增殖的抑制逐漸增加，橙皮苷作用48h，濃度為48～72μmol/L時抑制效果增加最明顯，抑制率已快速達到50%及以上，說明橙皮苷對翼狀胬肉HPF的增殖具有抑制作用，隨著濃度的不斷增加，抑制率的增加幅度逐漸減慢，隨著時間的遷延抑制率逐漸降低。此外，我們發現，橙皮苷可降低人翼狀胬肉HPF細胞中cyclin D的表達，48、72μmol/L濃度橙皮苷對cyclin D表達均有明顯的抑制作用，其效果與7.5μmol/L MMC相當。表明橙皮苷與MMC促凋亡作用機制具有相似性。由于橙皮苷具有天然無毒的優勢，其應用于臨床控制翼狀胬肉的生長及抑制翼狀胬肉術后復發具有更大的優勢。

綜上所述，本研究證實橙皮苷對人翼狀胬肉HPF細胞具有較強的抗增殖作用，提示橙皮苷具有成為新型抗增殖藥物的可能，但尚需進一步研究其對cyclin D的調控機制。鑒于藥物作用在體外有一定的差異，我們將進一步觀察橙皮苷對活體的療效及毒理學研究，為尋找新的預防翼狀胬肉復發的方法提供科學依據。