DHA玻璃體注射對ARMD大鼠模型光感受器細胞凋亡和PI3K/Akt通路的影響

王 輝，沈 玲，姬 翔

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)多發生于50歲以上老年人，又被稱為老年黃斑變性。隨著社會老齡化的加劇，ARMD發病率逐年上升，已成為第三大致盲原因，嚴重威脅中老年人身體健康[1]。ARMD分為干性和濕性兩種類型，臨床中以干性患者為主。目前，干性ARMD主要應用抗氧化劑進行治療，缺少有效的藥物緩解ARMD進展[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine threonine protein kinase，PI3K/Akt)信號通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，可調控下游多種活化因子，參與細胞的增殖、分化和凋亡等生命過程[3]。研究表明，PI3K/Akt信號通路在增殖性玻璃體視網膜病、后發性白內障、青光眼等多種眼科疾病的發生和發展過程中發揮關鍵作用[4]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是人體必須的不飽和脂肪酸，可促進視網膜光感受器細胞和中樞神經系統的發育。研究表明，DHA可能通過ROS/Nrf2途徑誘導視網膜色素上皮細胞表達HO-1，從而發揮對視網膜色素上皮細胞的保護作用[5]。飲食補充DHA可能通過提高胰島素敏感性，降低血清成纖維細胞生長因子21顯著改善非酒精性脂肪性肝病患者血脂水平[6]。DHA可降低人視網膜色素上皮細胞ARPE-19凋亡率，誘導ARPE-19細胞HO-1 mRNA和蛋白表達，對ARPE-19細胞發揮保護作用[7]。目前，DHA對ARMD患者光感受器影響的研究相對較少。本研究通過光損傷法建立ARMD大鼠模型，研究DHA對ARMD大鼠視網膜光感受器細胞凋亡的影響，并探討了其可能的作用機制，以期為該疾病的治療提供新方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性SD大鼠60只，清潔級，8周齡，體質量160～230g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證號：SCXK(滬)2017-0005。大鼠自由飲水和飲食，飼養溫度20℃～25℃，濕度50%～56%，光照12h。本研究經本院動物倫理委員會批準同意。

1.1.2實驗試劑和儀器DHA(批號：20171115)，美國Sigma公司；TUNEL試劑盒(批號：20171216)，瑞士羅氏(Roche)公司；TNF-α(批號：20171216)和IL-6(批號：20171329)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒(批號：20180125)，上海碧云天公司；NF-κBp65(批號：Bs-0467R)和p-NF-κBp65(批號：Bs-0458R)抗體，北京博奧森生物技術有限公司；PI3K(批號：Sc1236)和p-PI3K抗體(批號：Sc1152)，Santa Cruz公司；Akt(批號：9275)和p-Akt(批號：9246)抗體，美國Cell Signaling公司；Bax(批號：Sc1215)和Bcl-2(批號：Sc1237)抗體，美國Santa Cruz公司；cleved-caspase-3抗體(批號：20180214)，武漢博士德生物工程有限公司。珊頓石蠟切片機，英國；XSP-9CA光學顯微鏡，上海光學儀器一廠；H-600型透射電鏡，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組和模型建立大鼠適應性飼養7d后，按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、低劑量DHA組(L-DHA組)、中劑量DHA組(M-DHA組)和高劑量DHA組(H-DHA組)，每組12只。參照文獻方法采用視網膜光損傷法建立干性ARMD大鼠模型[8]。L-DHA組、M-DHA組和H-DHA組分別按劑量2.5、5.0、10μg/kg玻璃體注射DHA[9]。空白對照組和模型組注射等量生理鹽水。造模起開始治療，每10d注射一次，注射5次。

1.2.2標本采集最后一次給藥結束后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，斷頸處死，冰浴下摘取眼球，沿赤道部剖開，剝離視網膜組織。其中每組中6只大鼠右眼視網膜組織4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，HE染色后行病理學觀察和TUNEL檢測。6只大鼠的左眼視網膜組織2.5%戊二醛固定，行透射電鏡觀察。剩余6只大鼠視網膜組織-80℃保存備用。

1.2.3 TUNEL原位凋亡檢測石蠟切片經常規脫蠟處理、PBS沖洗后，將切片置于濕盒中，滴加50μL蛋白酶工作液，37℃水浴20min，PBS沖洗3次，滴加20μL TUNEL反應液，37℃水浴1h。PBS沖洗3次后，滴加20μL Converter-POD溶液，37℃水浴30min。PBS沖洗3次后，滴加50μL DAB工作液進行顯色反應，PBS沖洗。蘇木素復染10s，自來水漂洗，鹽酸、酒精分化數秒，自來水漂洗，1%氨水泛藍，自來水漂洗。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。400倍鏡下觀察TUNEL染色切片，分別計算外核層和神經節細胞層細胞凋亡指數(AI)。AI =凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4酶聯免疫吸附法測定視網膜組織TNF-α和IL-6水平取視網膜組織1g，添加9mL生理鹽水于勻漿器中制備組織勻漿液，3000r/min離心10min后，保留上清，參照酶聯免疫測定視網膜組織TNF-α和IL-6水平，在酶標包被板添加50μL標準品，設空白孔(不添加樣品和酶標試劑)、待測樣品孔，將40μL樣品、10μL親和素加入待測樣品孔，封板后37℃反應30min，清洗、拍干后，添加50μL酶標試劑(空白孔除外)，封板后37℃溫育30min，洗滌、拍干后，添加100μL顯色劑，37℃避光放置5min，添加50μL終止液結束反應，于450nm波長檢測各孔OD值，繪制標準品曲線計算樣品濃度。

1.2.5 Western Blot檢測蛋白表達取視網膜組織，充分裂解后，BCA法定量蛋白含量。取30μg蛋白質，加入上樣緩沖液，95℃煮沸5min，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白條帶轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1h。TBST洗膜后，分別加入Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2一抗(1∶300)，4℃孵育12h。TBST洗膜，加入HRP標記IgG二抗(1∶5000)，37℃孵育2h。TBST洗膜，加入ECL發光液，避光顯影，凝膠成像系統自動顯影，掃描Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，各蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2結果

2.1各組大鼠HE染色結果各組大鼠視網膜總厚度、外核層和內核層厚度比較，差異有統計學意義(F=175.879、12.668、19.387)。與空白對照組比較，模型組大鼠視網膜總厚度、外核層和內核層厚度均降低，差異有統計學意義(t=23.004、5.934、7.182，P<0.05)。與模型組比較，M-DHA組和H-DHA組大鼠視網膜總厚度、外核層和內核層厚度均升高，差異有統計學意義(tM-DHA組=13.427、3.099、4.349，tH-DHA組=19.733、5.050、5.985，P<0.05)；L-DHA組大鼠視網膜總厚度升高，差異有統計學意義(t=7.381，P<0.05)，外核層和內核層厚度升高，但差異無統計學意義(P>0.05，圖1，表1)。

圖1各組大鼠HE染色結果(×400)A：空白對照組；B：模型組；C：L-DHA組；D：M-DHA組；E：H-DHA組。

圖2各組大鼠TUNEL染色結果(×400)A：空白對照組；B：模型組(黑色箭頭所示為TUNEL陽性細胞)；C：L-DHA組；D：M-DHA組；E：H-DHA組。

圖3各組大鼠視網膜神經節細胞超微結構(×5000)A：空白對照組；B：模型組；C：L-DHA組；D：M-DHA組；E：H-DHA組。N：神經節細胞的細胞核；M：神經節細胞的線粒體；V：空泡。

組別視網膜總厚度外核層內核層空白對照組167.25±5.2122.37±2.6143.16±3.15模型組110.23±3.14a15.37±1.24a31.24±2.57aL-DHA組124.35±3.57c16.43±1.2833.11±2.59M-DHA組139.43±4.35c18.62±2.25c37.82±2.67cH-DHA組158.34±5.11c21.05±2.46c40.61±2.87c

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vs模型組。

2.2各組大鼠視網膜細胞凋亡情況如圖2所示，TUNEL陽性細胞(黑色箭頭)主要分布在神經節細胞層和視網膜外核層中。各組大鼠神經節細胞層和外核層細胞凋亡指數比較，差異有統計學意義(F=125.379、150.245，P<0.001)。與空白對照組比較，模型組大鼠神經節細胞層和外核層細胞凋亡指數升高，差異有統計學意義(t=20.579、19.833，P<0.05)。與模型組比較，M-DHA組和H-DHA組大鼠神經節細胞層和外核層細胞凋亡指數降低，差異有統計學意義(tM-DHA組=7.934、7.518，tH-DHA組=14.656、14.585，P<0.05)；L-DHA組降低，但差異無統計學意義(P>0.05，圖2，表2)。

組別神經節細胞層外核層空白對照組8.37±1.216.13±0.82模型組77.51±8.14a62.15±6.87aL-DHA組68.35±8.2356.43±6.12M-DHA組42.18±7.26c36.62±4.69cH-DHA組22.54±4.26c17.15±3.15c

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vs模型組。

2.3各組大鼠透射電鏡觀察超微結構視網膜神經節細胞超微結構見圖3。空白對照組視網膜神經節細胞具有均勻正常出現的細胞核和線粒體。模型組出現空泡化，染色質邊緣化，染色質濃縮，線粒體腫脹和嵴缺失。DHA治療后，空泡化、染色質邊緣化、染色質濃縮以及線粒體腫脹的不同程度改善。H-DHA組線粒體和細胞核基本正常，與空白對照組較為相似。

2.4各組大鼠視網膜組織TNF-α和IL-6水平比較各組大鼠視網膜組織TNF-α和IL-6表達水平比較，差異有統計學意義(F=18.729、80.136，P<0.001)。與空白對照組比較，模型組大鼠視網膜組織TNF-α和IL-6表達水平均升高，差異有統計學意義(t=6.846、13.079，P<0.05)。與模型組比較，M-DHA組和H-DHA組大鼠視網膜組織TNF-α和IL-6表達水平均降低，差異有統計學意義(tM-DHA組=4.132、6.828，tH-DHA組=5.824、11.965，P<0.05)；L-DHA組降低，但差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

圖4各組大鼠視網膜組織相關蛋白條帶A：空白對照組；B：模型組；C：L-DHA組；D：M-DHA組；E：H-DHA組。

組別TNF-αIL-6空白對照組1.21±0.343.42±0.28模型組2.97±0.53a7.15±0.64aL-DHA組2.58±0.476.73±0.53M-DHA組1.87±0.38c4.92±0.48cH-DHA組1.46±0.35c3.61±0.34c

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vs模型組。

組別p-PI3K/PI3Kp-Akt/AktBaxBcl-2p-NF-κBp65/NF-κBp65cleved-caspase-3空白對照組0.59±0.030.55±0.030.07±0.010.49±0.030.13±0.010.11±0.01模型組0.13±0.01a0.07±0.01a0.59±0.03a0.22±0.02a0.38±0.02a0.19±0.01aL-DHA組0.22±0.020.11±0.010.56±0.020.23±0.010.34±0.020.18±0.02M-DHA組0.39±0.02c0.26±0.02c0.32±0.02c0.29±0.02c0.26±0.03c0.16±0.03cH-DHA組0.48±0.03c0.39±0.02c0.12±0.01c0.35±0.030.15±0.02c0.13±0.02c

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vs模型組。

2.5各組大鼠視網膜組織相關蛋白表達各組大鼠視網膜組織Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白比較，差異有統計學意義(F=916.895、168.682、17.842、390.788、624.947、76.125，P<0.01)。與空白對照組比較，模型組大鼠視網膜組織Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表達升高，差異有統計學意義(t=40.279、27.386、 13.856，P<0.05)；p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達降低，差異有統計學意義(t=35.631、37.181、18.343，P<0.05)。與模型組比較，M-DHA組和H-DHA組大鼠視網膜組織Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表達降低，差異有統計學意義(tM-DHA組=18.343、8.152、2.324，tH-DHA組=36.406、19.919、6.573，P<0.05)；p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達升高，差異有統計學意義(tM-DHA組=28.482、20.813、3.184，tH-DHA組=27.111、35.054、8.832，P<0.05，圖4，表4)。

3討論

ARMD是一種眼科常見的視網膜黃斑退行性病變，由年齡、飲食、環境等多種因素引起的綜合病癥，對患者視力造成嚴重損傷[10]。目前，ARMD的發病機制尚不十分明確，但其病理已經證實與患者視網膜光感受器細胞的凋亡有密切關系。因此，開發新的能夠抑制光感受器細胞凋亡的藥物，延緩病情，減輕患者痛苦具有十分重要的意義。

DHA是人體必須的高度不飽和脂肪酸，不能由自身合成，主要從食物中獲取。DHA作用廣泛，具有抗神經炎癥、抗氧化等功能，對帕金森、老年癡呆、黃斑變性等疾病有一定的預防作用。有報道稱，與不含DHA藻油的大豆調和油飼養的大鼠相比，含DHA藻油的大豆調和油飼喂的SD大鼠視網膜組織細胞層次更為清楚，細胞生長正常并且排列緊密，桿狀細胞、錐狀細胞清晰可見，說明DHA有益于視網膜組織細胞的生長發育[11]。艾明等[12]研究表明，DHA可抑制N-甲基-N-亞硝脲(MNU)對視網膜光感受器細胞超微結構的損傷，具有較好的保護作用，是一種潛在延緩視網膜色素變性病程進展的有效藥物。本研究結果顯示，模型組大鼠視網膜總厚度、外核層和內核層厚度較空白對照組降低，視網膜神經節細胞層和外核層細胞凋亡指數升高，神經節細胞出現空泡化，染色質邊緣化，染色質濃縮，線粒體腫脹和嵴缺失現象，提示模型組大鼠視網膜光感受異常，細胞凋亡。經DHA治療后，可明顯改善視網膜神經節細胞染色質邊緣化和濃縮、線粒體腫脹等現象，增加視網膜總厚度、外核層和內核層厚度，以及降低視網膜神經節細胞層和外核層細胞凋亡指數，隨著給藥劑量的增加，視網膜神經節細胞逐漸得到恢復，具有劑量依賴性，與相關研究報道結果一致，提示DHA可保護ARMD大鼠光感受器細胞凋亡，可能是潛在治療ARMD疾病的藥物。

為了了解DHA保護ARMD大鼠光感受器細胞凋亡的作用機制，本研究基于PI3K/Akt信號通路進行了簡單探討。本研究結果顯示，與空白對照組比，模型組大鼠視網膜組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平降低，PI3K是一種可使肌醇環第3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K的下游作用靶點。PI3K被激活后生成的磷脂產物進一步激活Akt及其下游信號級聯反應，參與細胞的生長和發育、抗凋亡等過程。近年來研究發現，PI3K/Akt信號通路與眼部疾病關系密切[13]， 陳春麗等[14]發現上調ARMD視網膜色素上皮細胞PI3K/Akt信號通路，可降低細胞氧化應激損傷，發揮細胞保護作用。結合文獻本研究結果提示PI3K/Akt信號通路可能參與ARMD的發生。本研究發現玻璃體注射DHA后，p-PI3K和p-Akt蛋白水平升高，隨著注射劑量的升高，p-PI3K和p-Akt蛋白水平逐漸升高。玻璃體內注射DHA可減輕NaIO3誘導的ARMD大鼠模型的感光細胞損傷[7]。DHA抑制PI3K活性，進而降低非小細胞肺癌(NSCLC)細胞活力，誘導細胞凋亡[15]。基于此，本研究推測DHA可能通過激活PI3K/Akt信號通路，促進p-PI3K和p-Akt蛋白表達，DHA可能也通過PI3K/Akt信號通路緩解視網膜組織損傷，進而發揮對ARMD的保護作用。本研究結果顯示，模型組大鼠視網膜組織Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白、炎性因子TNF-α和IL-6表達升高，p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達降低；研究表明PI3K/Akt信號通路可促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，抑制細胞凋亡[16]；Dilly等[17]研究發現，激活PI3K/Akt信號通路能夠活化NF-κB上調TNF-α、IL-6等炎性因子的表達；仇志富等[18]研究發現，PI3K/Akt信號通路可抑制caspase-9磷酸化，降低caspase-3表達，降低細胞凋亡。以往研究證實，激活PI3K/Akt信號通路，可增強Bcl-2表達，下調Bax表達，促進慢性高眼壓SD大鼠初級視皮質神經元損傷的修復，改善神經元細胞超微結構以及降低眼壓[19]。基于以上研究推測ARMD大鼠視網膜組織損傷后下調PI3K/Akt信號通路，進而激活caspase-3通路，造成ARMD大鼠光感受器細胞凋亡。本研究結果顯示，經DHA干預后視網膜組織Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表達及炎性因子TNF-α和IL-6表達均降低，具有劑量依賴性。研究發現DHA可能通過Nrf2途徑誘導視網膜色素上皮細胞表達HO-1，降低視網膜色素上皮細胞凋亡，從而發揮對視網膜色素上皮細胞的保護作用[5]。推測DHA可能通過上調PI3K/Akt信號通路降低ARMD大鼠光感受器細胞凋亡，進而發揮對ARMD的保護作用。

綜上所述，DHA可降低ARMD大鼠光感受器的細胞凋亡，其可能通過激活PI3K/Akt信號通路，上調p-PI3K和p-Akt蛋白表達，進而抑制下游凋亡相關蛋白表達，從而發揮抗凋亡作用的，是治療ARMD的潛在藥物。本研究也存在一些不足，ARMD機制較復雜，DHA是否通過其它途徑發揮保護作用，還有待后續深入研究。