用改良的酶比色法測(cè)定嬰幼兒乳粉中膽堿的含量

□ 張 琳 賈 俊 吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 曲玉超 吉林天圓檢測(cè)有限責(zé)任公司付連娟 吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 武旭明 馮 吉 長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

膽堿（choline）是一種強(qiáng)有機(jī)堿性化合物，在動(dòng)物有機(jī)體內(nèi)的存在形式主要為游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等。膽堿及其衍生物是對(duì)人體非常重要的一類(lèi)具有生物功能的小分子代謝物，其重要意義在于能夠促進(jìn)神經(jīng)元的信息傳遞，特別是對(duì)嬰兒大腦的發(fā)育及代謝具有至關(guān)重要的作用。嬰幼兒由于攝入的食物比較單一，容易造成膽堿類(lèi)物質(zhì)缺失，可能因此造成免疫力降低、記憶力損害及腎臟損害等疾病[1,2]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14880-2012對(duì)嬰幼兒配方奶粉中膽堿的添加限量作了明確規(guī)定，限量為 380 ～ 1 500 mg/kg[3]。

比較常見(jiàn)的膽堿檢測(cè)方法有雷氏鹽比色法[4]、高氯酸非水滴定法[5]、雷氏鹽質(zhì)量法[6]等，由于選擇性不好，背景干擾因素比較多，可造成檢測(cè)偏差較大。

現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5413.20-2013[7]采用酶反應(yīng)顯色分光光度計(jì)法進(jìn)行奸惡，這種檢測(cè)膽堿含量的方法，優(yōu)點(diǎn)是專(zhuān)屬性較強(qiáng)，缺點(diǎn)是缺少對(duì)水解液的凈化處理，其樣品中的核黃素等發(fā)色物質(zhì)，經(jīng)水解后顏色加深，容易造成樣品背景值增高；此外樣品中含有的維生素C等還原性物質(zhì)，會(huì)影響酶的氧化反應(yīng)，容易造成膽堿測(cè)定值偏低，為克服以上檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題，本文將提出一種改良的酶比色法，用于測(cè)定嬰幼兒乳粉中膽堿的含量。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)）、電子天平（Metteler Toledo ML204）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）、pH計(jì)（PHS-3C），離心機(jī)。

試劑：99%膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)品、過(guò)氧化氫酶、膽堿氧化酶、磷脂酶D,4-氨基安替比林、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉與苯酚，活性炭粉，以上試劑皆為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

膽堿經(jīng)酸水解后，加入活性炭對(duì)水解液進(jìn)行凈化，再經(jīng)過(guò)酶氧化，然后發(fā)生顯色反應(yīng)，最后使用分光光度法進(jìn)行測(cè)試。

2.2 樣品處理

取5 g（精確到0.000 1 g）樣品，1 mol/L的鹽酸溶液30 mL，放在100 mL錐形瓶中，65～75 ℃水浴加熱，不時(shí)震蕩混勻，共需水解3 h，冷卻至室溫并用氫氧化鈉溶液（500 g/L）調(diào)pH為3.5～4.0，加入0.5～2.0 g活性炭后渦旋振蕩，離心過(guò)濾，將水解后的上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中。加入12倍配置好的酶反應(yīng)液，同時(shí)應(yīng)保證測(cè)試時(shí)濾液呈弱堿性，在37 ℃左右保溫反應(yīng)10～30 min，對(duì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取2、4、6 mL與8 mL的膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按表1加入試劑，然后按照2.2中的方法進(jìn)行處理。加入發(fā)色劑后，標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生顏色變化（見(jiàn)圖1），混勻，將試管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保溫反應(yīng)15 min。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)的試劑添加量

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度顏色圖

2.3.2 活性炭含量對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響

按表2中試劑的添加量要求，分別投放在準(zhǔn)備好的8支試管中進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，加入0.6 g活性炭能使測(cè)定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。由對(duì)比試管F、G、H可以看出，當(dāng)不使用活性炭進(jìn)行樣品脫色處理時(shí)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較差，回收率和重現(xiàn)性降低。

2.3.3 試樣的測(cè)定

按表3所示的試劑添加量進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試樣都準(zhǔn)備（B、C）2支試管。加入發(fā)色劑后標(biāo)準(zhǔn)溶液開(kāi)始顏色反應(yīng)，混勻后將試管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保溫反應(yīng)15 min。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.003 3x-0.018 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，線性良好（見(jiàn)圖2）。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取4種不同嬰幼兒配方奶粉5 g，用改進(jìn)的方法進(jìn)行檢測(cè)，同一種樣品取平行樣，分別測(cè)膽堿含量，見(jiàn)表4。（檢出限為1 mg/100 g，定量限為3 mg/100 g）

表2 測(cè)定加標(biāo)樣時(shí)的試劑添加量

表3 試劑添加量表格

圖2 膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表4 膽堿含量

4 結(jié)論

通過(guò)添加活性炭等步驟，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行改良，去除了維生素C等還原性物質(zhì)對(duì)酶氧化反應(yīng)的影響并減小背景值，該方法對(duì)嬰幼兒乳粉中膽堿含量的測(cè)定更加準(zhǔn)確、可行、高效。