冷凍消融術(shù)治療Lewis肺癌小鼠移植瘤侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

孫滿強(qiáng)，胡凱文，陳 琪，何樂(lè)毅凡，龐皓玥，李龍宇，周 天

冷凍消融術(shù)作為一種新興的微創(chuàng)治療技術(shù)具有低損傷、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，目前冷凍消融術(shù)復(fù)溫常采用兩種復(fù)溫范圍，分別是20 ℃～40 ℃和0 ℃～15 ℃，術(shù)者在復(fù)溫選擇時(shí)常常依據(jù)經(jīng)驗(yàn)和習(xí)慣。當(dāng)前關(guān)于冷凍消融機(jī)制的研究多體現(xiàn)在免疫方面，冷凍消融術(shù)不具有擴(kuò)大型手術(shù)的特性，關(guān)于術(shù)后不同復(fù)溫溫度對(duì)殘存瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性影響的實(shí)驗(yàn)研究較少。堿性-環(huán)-螺旋蛋白(Twist)是編碼位于常染色體的堿性-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在正常胚胎發(fā)育中調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及組織重組，因其被發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用而備受關(guān)注，可調(diào)控上皮—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)和血管新生[1]。該實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)Twist、鈣黏附蛋白E(E-Cadherin)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)，探究冷凍消融術(shù)后冰球復(fù)溫溫度與殘存瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和瘤株45只SPF級(jí)C57BL/6小鼠，4～5周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。Lewis肺癌小鼠細(xì)胞(lewis lung cancer，LLC)購(gòu)自美國(guó)CA公司。LLC細(xì)胞用含10%FBS(英國(guó)Biochrom公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司)進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳時(shí)進(jìn)行收集，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/ml，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射造模。

1.2 主要儀器和試劑冷凍消融術(shù)采用海杰亞CHS 800001手術(shù)系統(tǒng)，購(gòu)自北京海杰亞醫(yī)療器械有限公司；Leica2135石蠟病理切片機(jī)、Leica病理組織包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Anti-Twist單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Anti-E-Cadherin單克隆抗體、Anti-VEGF-A單克隆抗體、Anti-VEGF-C單克隆抗體、羊抗兔/鼠IgG H+L抗體(二抗)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 造模取100 μl細(xì)胞懸液(106個(gè)細(xì)胞)皮下注射于45只小鼠右側(cè)背部。密切觀察小鼠生長(zhǎng)狀況。

1.4 超低溫冷凍消融術(shù)造模24 d后，將45只荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、復(fù)溫至0 ℃組(T0組)、復(fù)溫至40 ℃組(T40組)，每組15只。對(duì)照組未予任何干預(yù)，T0組予100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定后，備皮，消毒，采用海杰亞冷凍消融設(shè)備實(shí)行冷凍手術(shù)。將1.66 mm冷凍刀頭插入腫瘤中央，采用單循環(huán)冷凍方法，當(dāng)冷凍范圍到達(dá)癌旁組織時(shí)開始升溫，直到腫瘤中心溫度到達(dá)0 ℃，停止復(fù)溫，拔出探針。T40組操作如上，當(dāng)腫瘤中心溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，拔出探針。冷凍消融術(shù)第1天記為第0天(Day0，D0)。

1.5 取材小鼠的體質(zhì)量每隔1 d記錄1次，在術(shù)后第14天(D14)進(jìn)行脫頸處死，剝離腫瘤并進(jìn)行稱重，計(jì)算腫瘤抑制率=([對(duì)照組平均腫瘤重量]-[實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量])/[對(duì)照組平均腫瘤重量]×100%。腫瘤稱重后放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)。

1.6 免疫組化染色法檢測(cè)取包埋后的組織修剪邊緣后裝入切片機(jī)作4 μm切片，烘箱過(guò)夜進(jìn)行脫蠟，脫蠟后將標(biāo)本進(jìn)行阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗后將標(biāo)本架置于pH 9.0 抗原修復(fù)液中進(jìn)行修復(fù)(置于微波爐中高火7 min，中低火15 min)，用自來(lái)水復(fù)溫后取適量Anti-Twist抗體用一抗稀釋液稀釋至合適濃度(稀釋濃度1 ∶100)孵育標(biāo)本30 min，沖洗后滴加二抗孵育20 min，最后進(jìn)行DAB顯色，封片后用顯微鏡觀察Twist蛋白表達(dá)及分布(按照抗體說(shuō)明書及文獻(xiàn)，Twist陽(yáng)性表現(xiàn)為胞核出現(xiàn)黃色或棕色的顆粒狀物質(zhì)沉積)。Twist蛋白表達(dá)水平以平均光密度值(Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像所得)表示。同理，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行E-Cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠冷凍消融術(shù)后體質(zhì)量比較對(duì)小鼠術(shù)后各時(shí)間段體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表1。對(duì)照組小鼠體質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率計(jì)算對(duì)照組腫瘤質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組平均腫瘤抑制率為25.14%，T40組平均腫瘤抑制率為15.85%，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.3 各組腫瘤組織中Twist、E-cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，高倍鏡下觀察，用細(xì)胞內(nèi)棕黃色強(qiáng)弱來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的高低，結(jié)果以平均光度值來(lái)表示。T0組Twist表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，T40組Twist表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T0組E-Cadherin表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，T40組E-Cadherin表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T0組VEGF-A表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，T40組VEGF-A表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T0組VEGF-C表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01)，T40組VEGF-C表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和腫瘤質(zhì)量變化

與對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

冷凍消融手術(shù)具有安全、有效、微創(chuàng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于中晚期肺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌等惡性腫瘤的治療[2-3]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于氬氦刀抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制研究主要體現(xiàn)在溶解效應(yīng)、凋亡效應(yīng)、微血栓形成和免疫效應(yīng)4個(gè)方面[4-8]。0 ℃以上的復(fù)溫溫度均可使冰球融化，但是不同復(fù)溫溫度是否會(huì)對(duì)殘存瘤侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響的相關(guān)研究較少。

當(dāng)前研究[9-10]表明，EMT和血管新生是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。EMT過(guò)程可使具有極性特點(diǎn)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞，利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。E-Cadherin減少是EMT過(guò)程中的重要表現(xiàn)[11-12]。腫瘤組織血流供應(yīng)增強(qiáng)是腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志，VEGF具有促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增加血管通透性，以及協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)等作用[13]。VEGF-A主要促進(jìn)血管內(nèi)皮新生，VEGF-C主要促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮新生。而Twist蛋白對(duì)于E-Cadherin 和VEGF均有調(diào)控作用，Twist在多種人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并直接導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，致使上皮細(xì)胞間黏附力降低，細(xì)胞失去上皮特征、從原位脫落、運(yùn)動(dòng)能力加強(qiáng)，并在侵襲帶形成偽足、組裝張力絲并召集細(xì)胞基質(zhì)降解酶，為侵襲轉(zhuǎn)移提供了必要前提[10]。轉(zhuǎn)染Twist的腫瘤細(xì)胞可增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤微血管、微淋巴管生成，而通過(guò)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調(diào)Twist則可見VEGF表達(dá)量下降，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)得其mRNA呈同樣變化趨勢(shì)[14]。由此得知Twist、E-Cadherin、VEGF是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的重要蛋白，而E-Cadherin和VEGF的表達(dá)受Twist調(diào)控。

圖1 各組腫瘤組織免疫組化結(jié)果 ×400

圖2 各組腫瘤組織中Twist平均光密度值 與對(duì)照組比較：*P<0.05

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在手術(shù)之后體質(zhì)量減少，這與剪開皮毛，暴露腫瘤的手術(shù)損傷有關(guān)。對(duì)照組腫瘤質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，表明冷凍消融術(shù)對(duì)腫瘤起到抑制作用。進(jìn)一步行免疫組化發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，T0組和T40組的Twist、VEGF-A、VEGF-C蛋白表達(dá)降低，E-Cadherin蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。T0組和T40組在腫瘤抑制率和相關(guān)蛋白表達(dá)方面差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但T0組在各項(xiàng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方面均優(yōu)于T40組。由此得出：冷凍消融術(shù)后0 ℃復(fù)溫相較于40 ℃復(fù)溫對(duì)于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性具有更好的抑制作用，其機(jī)制與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管新生兩個(gè)過(guò)程有關(guān)。氬氣和氦氣是稀有氣體，具有很高的價(jià)值性和戰(zhàn)略性，0 ℃復(fù)溫符合環(huán)保節(jié)能的原則，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于氬氦刀術(shù)后復(fù)溫溫度選擇具有一定指導(dǎo)意義。本研究只從組織層面對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行驗(yàn)證，缺少基因轉(zhuǎn)錄層面的驗(yàn)證，并且腫瘤的表觀層面缺乏更強(qiáng)的說(shuō)服性，以上是本實(shí)驗(yàn)的不足和待改進(jìn)之處。除此之外，冷凍消融對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響是多方面的，以上只是從轉(zhuǎn)移角度進(jìn)行探索，在炎癥、免疫方面的探索將是后續(xù)的研究方向。