乳腺癌細(xì)胞HMGA1穩(wěn)定株構(gòu)建及對細(xì)胞增殖的影響

胡芳琳，鐘小林，陳亞軍,2,3，鐘 警

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來乳腺癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升，并有年輕化趨勢，已成為威脅女性健康的重要原因[1-2]。研究[3]表明，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，但其致病機(jī)制尚不清楚。高遷移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。HMG分為3大類：HMGB、HMGN及HMGA，各大類又可分成不同亞型，這些蛋白質(zhì)以聚丙烯酰胺凝膠中的快速電泳遷移率命名。其中HMGA1是癌細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的最豐富的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白[4]。目前研究[5]表明HMGA1參與了多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、分化、凋亡、炎癥、血管生成及DNA損傷修復(fù)等。越來越多的證據(jù)表明HMGA1在惡性腫瘤中廣泛高表達(dá)，其高水平表達(dá)預(yù)示某些腫瘤的不良預(yù)后[6]，有望成為腫瘤治療的有效靶點(diǎn)之一[7-8]。為進(jìn)一步研究HMGA1 在人乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制，該研究將利用遺傳霉素(geneticin，G418)篩選乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株，并探討HMGA1高表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF7及T47D購自上海中科院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)(購自美國Gibco 公司)中，在37 ℃、 5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d給細(xì)胞更換一次培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.2 HMGA1過表達(dá)載體構(gòu)建提取MCF7細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR獲得HMGA1開放閱讀框(open reading frame, ORF)，引物序列如下：HMGA1-P1：5′-GCT GGA TAT CTG CAG AAT TCC GCC ACC ATG AGT GAG TCG AGC TCG AAG-3′, HMGA1-P2:5′-TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCT CAC TGC TCC TCC TCC GAG-3′， 引物由吉凱基因合成。HMGA1 ORF經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，回收酶切后的產(chǎn)物，將產(chǎn)物與 GV219[pcDNA3.1(-)]載體(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司) 經(jīng)T4 Ligase及T4 DNA Buffer在4 ℃條件下連接16 h，次日取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)大腸桿菌，鋪瓊脂平板(含50 μg/ml 氨芐青霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落，經(jīng)小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并純化后送上海生工生物技術(shù)公司測序鑒定。

1.3 確定G418最佳篩選濃度G418購自上海absin公司。實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞消化成單個的細(xì)胞懸液，并分別均勻接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁并長至孔板面積的70%時，分別用含不同濃度的G418(0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μg/ml)完全培養(yǎng)基處理乳腺癌MCF7及T47D細(xì)胞。然后按照上述G418濃度梯度，每2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基(含G418)，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，將細(xì)胞培養(yǎng)10～14 d，觀察對比各孔中剩余細(xì)胞數(shù)量，將無活細(xì)胞的孔對應(yīng)的G418濃度作為穩(wěn)定株篩選濃度。并在穩(wěn)定株的培養(yǎng)中使用半量維持劑量。

1.4 乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株構(gòu)建將乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞分別接種于12孔板中，均分為2組：空載體組[轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)空載體]和HMGA1高表達(dá)組[轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-HMGA1質(zhì)粒]。待細(xì)胞長至孔板面積70%時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染前吸去培養(yǎng)基，用PBS潤洗兩遍，每孔加入840 μl DMEM培養(yǎng)基；準(zhǔn)備溶液A(取2 μg質(zhì)粒,以80 μl無血清培養(yǎng)基混勻)和溶液B(取2 μl Lipo2000，以 80 μl無血清培養(yǎng)基混勻)；將溶液A逐滴加入溶液B中，混勻，并于室溫下放置25 min 后將上述液體對應(yīng)加入12孔板中；12孔板置于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞分別使用最佳篩選濃度 G418的完全培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，篩選10～14 d后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，待其逐漸增大后，刮除法結(jié)合有限稀釋法在96孔板中篩選陽性克隆，待其細(xì)胞增多后逐步將細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板、12孔板、6孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.5 Western blot采用Western blot檢測經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)后各克隆細(xì)胞株中HMGA1的表達(dá)。首先根據(jù)細(xì)胞的量分別加入適量的細(xì)胞裂解液，將吹打混勻后的細(xì)胞冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。采用BCA法(BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司)對樣本蛋白進(jìn)行定量。然后加入蛋白上清液總體積四分之一的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，在95 ℃、10 min的條件下將蛋白變性，再將變性后的蛋白在12% SDS-PAGE 膠中進(jìn)行電泳分離，然后將電泳后SDS膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入10%的牛奶封閉2 h后，孵育HMGA1 一抗( 1 ∶1 000) 1 h，洗膜，然后孵育羊抗小鼠 IgG(1 ∶3 000) 1 h，洗膜。隨后取適量ECL顯影液充分覆蓋PVDF膜蛋白質(zhì)面，化學(xué)發(fā)光檢測儀成像。

1.6 MTT比色法將穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1(-)空載體(pcDNA3.1)和pcDNA3.1(-)-HMGA1質(zhì)粒(HMGA1)的乳腺癌細(xì)胞分別接種于96孔板中，每個組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)約2 000個，共接種5塊96孔板。將5塊96孔板分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96、120 h。在培養(yǎng)終止前4 h將20 μl 5 mg/ml的MTT液體加入96孔板中各實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中，其余未達(dá)到培養(yǎng)時間的96孔板無需換液。4 h后，將加了MTT液體的96孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸出原培養(yǎng)液，然后將各實(shí)驗(yàn)孔中加入150 μl DMSO，振蕩5～10 min，使甲瓚顆粒完全溶解。將96孔板放在490 nm波長的酶標(biāo)儀下進(jìn)行光密度(optical density，OD)值測量,繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 克隆形成將穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1(-)空載體(pcDNA3.1)和pcDNA3.1(-)- HMGA1質(zhì)粒(HMGA1)的乳腺癌細(xì)胞分別接種于6孔板中，每個組設(shè)置3個復(fù)孔，使每孔的細(xì)胞數(shù)在1 000個。將6孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，期間每2～3 d給細(xì)胞更換一次培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。14 d后將孔板中的原培養(yǎng)基吸出，PBS潤洗。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，30 min后再用1 ml PBS洗細(xì)胞1次。每孔加入500 μl GIEMSA染液，染細(xì)胞20 min。每孔加入1 ml一級水洗滌細(xì)胞數(shù)次，直到6孔板背景干凈。晾干后用相機(jī)拍照，并繪圖進(jìn)行克隆細(xì)胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HMGA1表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定HMGA1序列成功插入到 GV219[pcDNA3.1(-)]載體，見圖1；EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定后送公司測序，測序結(jié)果為單一尖峰，與NCBI參考序列比對符合預(yù)期 ，見圖2。證明HMGA1基因已成功轉(zhuǎn)入GV219[pcDNA3.1(-)]載體。

2.2 確定G418濃度MCF7和T47D細(xì)胞在不同濃度梯度的G418培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。培養(yǎng)10 ～14 d后，觀察到MCF7細(xì)胞在600 μg/ml濃度下細(xì)胞基本死亡，所以確定MCF7穩(wěn)定細(xì)胞株篩選濃度為600 μg/ml，后續(xù)半量維持濃度為300 μg/ml；T47D細(xì)胞在500 μg/ml濃度下細(xì)胞基本死亡。所以確定T47D穩(wěn)定細(xì)胞株篩選濃度為500 μg/ml，后續(xù)半量維持濃度為250 μg/ml。

2.3 乳腺癌MCF7克隆株HMGA1表達(dá)情況為檢測乳腺癌MCF7克隆株HMGA1表達(dá)情況，將MCF7細(xì)胞分成3組，分別為空白對照組(blank con-trol group，CON)、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)空載體為陰性對照組(negative control，NC)以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-HMGA1質(zhì)粒的HMGA1穩(wěn)定高表達(dá)組(HMGA1組)。單因素方差分析結(jié)果顯示HMGA1穩(wěn)定高表達(dá)組HMGA1的表達(dá)明顯升高(P<0.001)，見圖3。Post分析結(jié)果顯示MCF7-NC組HMGA1蛋白表達(dá)相對量與CON組比較無明顯差異；而MCF7-HMGA1-3組HMGA1蛋白相對含量與CON組相比明顯升高(P<0.001)。最后確定MCF7-NC為穩(wěn)定株對照細(xì)胞，MCF7-HMGA1-3為HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株細(xì)胞。

圖1 HMGA1過表達(dá)載體構(gòu)建

A：GV219載體；B：載體酶切電泳;1：載體酶切產(chǎn)物;2：未酶切載體;M：Marker；C：HMGA1基因PCR擴(kuò)增電泳圖;3：擴(kuò)增產(chǎn)物，M：Marker；D：重組載體PCR鑒定;4：陰性對照(重蒸水)；5：陰性對照(空載體自連對照組);6：陽性對照(GAPDH); M：Marker；7～14：HMGA1 1-8號轉(zhuǎn)化子

圖2 構(gòu)建 pcDNA3.1(-)/HMGA1質(zhì)粒鑒定

A： HMGA1質(zhì)粒測序結(jié)果峰圖； B： 測序結(jié)果與NCBI參考序列比對結(jié)果

2.4 乳腺癌T47D克隆株HMGA1表達(dá)情況為檢測乳腺癌T47D克隆株HMGA1表達(dá)情況，將T47D細(xì)胞分成3組，分別CON組、NC組及HMGA1組。單因素方差分析結(jié)果顯示HMGA1穩(wěn)定高表達(dá)組HMGA1的表達(dá)明顯升高(P<0.001)，見圖4。Post分析結(jié)果顯示T47D-NC-1組HMGA1蛋白表達(dá)(0.507 6±0.028 79)與CON組(0.536 8±0.006 65)相比無明顯差異；而T47D-HMGA1-2(1.842 0±0.040 65)與 T47D-HMGA1-3(1.336 0±0.032 90)組的HMGA1蛋白表達(dá)明顯高于CON組(P<0.001)。最后確定T47D-NC-1為穩(wěn)定株對照細(xì)胞，T47D-HMGA1-2與T47D-HMGA1-3為HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株細(xì)胞。

圖3 乳腺癌MCF7克隆株HMGA1的表達(dá)

1～3：同時做的3個復(fù)孔；與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖4 乳腺癌T47D克隆株HMGA1的表達(dá)

1～3：相應(yīng)組中同時做的復(fù)孔；與CON組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.5 HMGA1高表達(dá)對MCF7細(xì)胞增殖的影響為了解高表達(dá)HMGA1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后對細(xì)胞增殖能力的影響，將HMGA1組細(xì)胞(MCF7-HMGA1-3)及pcDNA3.1(MCF7-NC)組細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，使用MTT法在細(xì)胞培養(yǎng)的1、2、3、4、5 d進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：相對于pcDNA3.1組細(xì)胞，HMGA1組細(xì)胞增殖更快，且在第4天后HMGA1高表達(dá)組的OD490明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖5A。細(xì)胞平板克隆形成檢測HMGA1組及pcDNA3.1組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明HMGA1組細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯高于pcDNA3.1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.02，P<0.001，n=3)，見圖5B、C。以上結(jié)果提示HMGA1高表達(dá)促進(jìn)MCF7細(xì)胞的增殖。

圖5 HMGA1穩(wěn)定高表達(dá)對MCF7細(xì)胞增殖能力的影響

A：MTT法檢測HMGA1組與pcDNA3.1組細(xì)胞的增殖能力；B、C： 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HMGA1組與pcDNA3.1組細(xì)胞的增殖能力；與pcDNA3.1組比較：***P<0.001

2.6 HMGA1高表達(dá)對T47D細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組比較，HMGA1組(T47D-HMGA1-2)中的細(xì)胞增殖能力(OD490值)在第3天開始顯著增加(P<0.001)，見圖6A。同時克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示，HMGA1組細(xì)胞的克隆形成數(shù)(196.7±6.667)明顯高于pcDNA3.1組(95.0±7.638)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.03，P<0.001，n=6)，見圖6B、C。以上結(jié)果提示HMGA1高表達(dá)對T47D細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用。

圖6 HMGA1穩(wěn)定高表達(dá)對T47D細(xì)胞增殖能力的影響

A： MTT法檢測HMGA1組與pcDNA3.1組細(xì)胞的增殖能力；B、C：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HMGA1組與pcDNA3.1組細(xì)胞的增殖能力；與pcDNA3.1組比較：***P<0.001

3 討論

研究[9]報道HMGA1在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。本研究為了探討HMGA1在乳腺癌中的作用，成功構(gòu)建了人乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞的HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，并用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測了HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株的增殖能力明顯強(qiáng)于普通MCF7和T47D細(xì)胞株。

HMGA1是癌細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的最豐富的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白[4]，HMGA1本身沒有轉(zhuǎn)錄活性，但其含有3個特征性的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為AT鉤。AT鉤可以結(jié)合DNA小溝內(nèi)富含AT的片段，與DNA結(jié)合后，募集其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與染色質(zhì)開放過程，并可與其他轉(zhuǎn)錄因子聚合，形成“增強(qiáng)子”來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，被稱為“結(jié)構(gòu)性核轉(zhuǎn)錄因子”。盡管HMGA1在轉(zhuǎn)錄中的作用已經(jīng)確立，但HMGA1在腫瘤中的作用尚不完全明確。

首次將HMGA1蛋白與癌癥聯(lián)系起來的證據(jù)是在高度增殖的人宮頸癌HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了豐富的染色質(zhì)結(jié)合蛋白[4]。隨后的研究表明，HMGA1在快速分裂的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[10]，但在大多數(shù)成人的組織中低水平表達(dá)或不表達(dá)[11]。在近期的研究中，Martinez Hoyos et al[12]利用基因芯片檢測和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中Pim-2原癌基因可被HMGA1誘導(dǎo)，而Pim-2是在細(xì)胞存活及增殖中起作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶。Belton et al[13]研究顯示HMGA1在轉(zhuǎn)基因小鼠的腸道中可促進(jìn)增殖和息肉形成，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Wood et al[14]采用基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)HMGA1參與人乳腺上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制Burkitts淋巴瘤中的HMGA1表達(dá)可顯著阻斷細(xì)胞增殖。Scala et al[15]研究表明HMGA1低表達(dá)可使肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌細(xì)胞增殖減少。在移植了乳腺癌細(xì)胞的小鼠模型中，敲除HMGA1基因可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移[16]。以上研究顯示腫瘤中HMGA1高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。本研究成功構(gòu)建了人乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株，并進(jìn)一步通過MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株增殖能力明顯增強(qiáng)，但 HMGA1具體通過何種機(jī)制參與乳腺癌細(xì)胞增殖過程還有待進(jìn)一步闡明。

本實(shí)驗(yàn)利用高表達(dá)HMGA1的pcDNA3.1(-)-HMGA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞，經(jīng)過抗藥性篩選，建立過表達(dá)HMGA1的穩(wěn)定株。通過 Western blot證實(shí)HMGA1在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的MCF7和T47D細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)，并進(jìn)一步利用MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGA1高表達(dá)穩(wěn)定株增殖能力明顯增強(qiáng)。為從分子水平上研究HMGA1對乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控作用提供了體外細(xì)胞系模型，為研究HMGA1與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。