人黑色素瘤抗原A3在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)研究

石若冰，王 琰，何海鵬，李 青，馬 英，梁義娟，劉 金，齊 冀，高新萍

宮頸癌(cervical cancer, CC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，宮頸癌CC的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第三位[1-2]。黑色素瘤抗原(melanoma antigen gene，MAGE)屬于癌睪抗原(cancer testis gene, CTA)，在正常組織中CTA 僅表達(dá)于睪丸和胎盤中，而在各種腫瘤組織中呈高表達(dá)[3-5]，其中MAGE-A3 為MAGE-A 家族重要成員，是目前已知的免疫原性最強(qiáng)、能被免疫細(xì)胞識(shí)別的肽表位最多的抗原。因此MAGE-A3在CC的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用日益受到學(xué)者的關(guān)注。該研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法、Western blot和RT-qPCR法分別檢測(cè)了MAGE-A3在宮頸組織和CC細(xì)胞株中的表達(dá)情況，初步探討了MAGE-A3在CC中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng) CC細(xì)胞株HeLa、SiHa和C-33A購(gòu)自北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在含5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。作為正常對(duì)照的細(xì)胞株End1/E6E7(購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心)，用含0.05 mg/ml牛垂體提取物(bovine pituitary extract, BPE)和0.1 ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(human recombinant epidermal growth factor, EGF)的角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte-serum free medium, K-SFM)培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件同前。

1.1.2組織標(biāo)本 60例組織標(biāo)本取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2015年1月～2017年1月間首診并行婦科手術(shù)患者的宮頸組織。收集存檔蠟塊標(biāo)本，其中正常宮頸組織20例(標(biāo)本均來源于本院因子宮肌瘤等良性病變行子宮全切術(shù)后的宮頸切片標(biāo)本)，CC組織40例(所有患者術(shù)前均未進(jìn)行腫瘤的放療及化療)。所有病例均需經(jīng)病理診斷證實(shí)，所有患者均排除患其他惡性腫瘤疾病或急慢性疾病。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組化法 將石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化后,0.01%枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加適量3%雙氧水，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴1滴正常山羊血清封閉液(試劑A)，室溫下孵育15 min，每張切片加適當(dāng)稀釋后的MAGE-A3一抗工作液約50 μl；空白對(duì)照組加PBS液約50 μl，置于4 ℃冰箱過夜孵育。滴加稀釋后的二抗50 μl(試劑B)，滴加過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(試劑C)，最后滴加DAB 溶液顯色，光鏡下觀察切片。以胎盤組織做陽(yáng)性對(duì)照。顯微鏡下觀察，于細(xì)胞中見棕黃色顆粒的為MAGE-A3陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.2RT-qPCR 收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用TRIzol試劑盒提取RNA,經(jīng)紫外分光光度儀進(jìn)行RNA濃度和純度的測(cè)定，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qRCR反應(yīng)條件為45 ℃、50 min。利用Pubmed查找基因的序列號(hào)，上海生科公司利用基因序列號(hào)合成相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物，MAGE-A3上游引物序列：5′-GGGACGGACATCTTCACTGG-3′； MAGE-A3下游引物序列：5′-CCACCAATTCTTGTGGCACC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCT-3′；內(nèi)參GAPDH下游引物序列：5′-AGGTCCACCACTACACGTTT-3′。將反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀上94 ℃預(yù)變性3 min，然后開始PCR循環(huán)：94 ℃、15 s，65 ℃ 、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延長(zhǎng)10 min。所取數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Western blot 收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞后，裂解細(xì)胞提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量(采用BCA法蛋白定量)，配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量30 μl，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，與MAGE-A3抗體(稀釋度1 ∶2 000)4 ℃搖床慢慢搖晃過夜孵育，洗膜后，與抗鼠二抗(稀釋度1 ∶3 000)37 ℃培養(yǎng)箱慢慢搖晃孵育2 h，洗膜后將顯影液加于PVDF膜上。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)宮頸組織中MAGE-A3的表達(dá)MAGE-A3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈淺黃色至棕褐色。其在正常宮頸組織和CC組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為0%(0/20)和70%(28/40)。在20例正常宮頸組織中MAGE-A3均呈陰性表達(dá)，在40例CC組織中28例呈陽(yáng)性表達(dá)，12例呈陰性表達(dá)。CC組表達(dá)高于正常宮頸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.25，P<0.05)。見圖1。

2.2 RT-PCR檢測(cè)宮頸細(xì)胞中MAGE-A3 mRNA的表達(dá)檢測(cè)基因MAGE-A3的mRNA水平結(jié)果顯示，CC細(xì)胞組與正常宮頸細(xì)胞組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而3種CC細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖1 正常宮頸組織和宮頸癌組織中MAGE-A3的表達(dá) SP×200 A：正常宮頸組織；B：宮頸癌組織

圖2 4種宮頸細(xì)胞中MAGE-A3 mRNA的表達(dá)比較 與正常宮頸細(xì)胞(End1/E6E7)組比較：*P<0.05

2.3 Western blot檢測(cè)宮頸細(xì)胞中MAGE-A3蛋白的表達(dá)MAGE-A3蛋白在3株CC細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中的表達(dá)與mRNA相似，CC細(xì)胞組與正常宮頸細(xì)胞組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而3種CC細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 4種宮頸細(xì)胞中MAGE-A3蛋白的表達(dá)比較 與正常宮頸細(xì)胞(End1/E6E7)組比較：*P<0.05

3 討論

MAGE-A3表達(dá)于多種惡性腫瘤，而在正常組織中不表達(dá)(除睪丸和胎盤外)，具有腫瘤特異性，是腫瘤特異性免疫治療的理想靶點(diǎn)[3]。研究[6-8]顯示，MAGE-A3基因在黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、喉癌[9]等多種腫瘤中有不同程度的表達(dá)。Hatiboglu et al[10]通過研究得出MAGE-A與非轉(zhuǎn)移性腎癌的預(yù)后不良有關(guān)。Han et al[11]通過對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的組織研究表明，MAGE-A表達(dá)是喉鱗癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，MAGE-A高表達(dá)提示喉癌患者預(yù)后不良。Gu et al[9]通過對(duì)肝細(xì)胞癌的分析數(shù)據(jù)表明MAGE-A高表達(dá)是肝癌患者不利預(yù)后的生物標(biāo)志物。Duan et al[12]研究表明MAGE-A3抗原在腫瘤的邊緣有表達(dá)，炎癥組織、良性腫瘤及癌旁組織中則不表達(dá)，這一特點(diǎn)為MAGE-A3用于腫瘤分子學(xué)診斷和免疫治療創(chuàng)造了條件。

本研究中，使用免疫組化法評(píng)估了CC組織中的MAGE-A3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示MAGE-A3在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)。這與Yin et al[13]在膀胱移行細(xì)胞癌的研究結(jié)果一致。提示CC組織中MAGE-A3相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織。

本研究顯示，MAGE-A3基因在CC細(xì)胞株Hela、SiHa、C-33A中呈高表達(dá)，在正常宮頸細(xì)胞株End1/ E6E7細(xì)胞中表達(dá)量極低。這就說明MAGE-A3可能參與了CC的發(fā)生和發(fā)展，并在此過程中可能發(fā)揮著一定的作用。因此下一步工作將探討MAGE-A3是否在CC侵襲、轉(zhuǎn)移以及增殖中發(fā)揮作用，并深入研究其作用機(jī)制，從而為MAGE-A3是否為CC的促癌基因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Russo et al[14]利用能表達(dá)MAGE-A3的轉(zhuǎn)基因的淋巴細(xì)胞MAGE-A3-GML治療黑色素瘤患者，10例患者中3例表現(xiàn)出外周循環(huán)血中抗MAGE-A3 T細(xì)胞增加，并且促進(jìn)皮膚關(guān)于MAGE-A3遲發(fā)型過敏反應(yīng)的發(fā)生。但其中有2例患者抗MAGE-A3的T細(xì)胞不僅在血液中被檢出，在腫瘤組織中也能被檢出，表明MAGE-A3-GML的注射能誘導(dǎo)抗腫瘤的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞能浸潤(rùn)到腫瘤組織內(nèi)部。王謙 等[15]通過MAGE-A3蛋白刺激獲得能夠呈遞其抗原的成熟樹突狀細(xì)胞，再用該細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞而獲得能夠識(shí)別MAGE-A3蛋白的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，表明MAGE-A3-DC-CD8+CTL具有特異性的腫瘤殺傷能力。由此可見，MAGE-A3是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。