異丙腎上腺素對大鼠牙移動過程中牙槽骨微結構的影響

羅金莉，杜希希，袁小平

正畸牙移動過程中，成骨和破骨的活動可以通過交感神經系統調節，在破骨細胞及成骨細胞的表面都有腎上腺素能受體存在，β2-腎上腺素受體(β2-adrenergicreceptor，ADRB2)可通過交感神經系統的支配對骨進行負向調節。核因子-κB 激活受體配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)是目前所知的能夠直接刺激促進前體破骨細胞分化成熟和激活成熟的破骨細胞的細胞因子[1]。Mirco-CT是用來研究動物骨小梁結構改變的有力輔助工具[2]。牙槽骨中骨體積分數(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁分離度(trabecular spcing，Tb.Sp)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)等指標的測定被一些學者用來了解某些藥物對正畸過程中骨改建的作用[3]。本研究旨在利用Micro-CT以及檢測ADRB2、RANKL的表達量來研究異丙腎上腺素對大鼠牙移動過程中牙槽骨微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康的8周齡SPF級SD雌性大鼠50只，由西南醫科大學動物實驗中心提供，體質量200～250 g，分籠飼養，每籠5只，保持室溫25 ℃，自由飲水及飲食。

1.2 儀器與材料PET/CT(西門子Inveon micro-PET/CT)；鹽酸ISO(上海麥克林生化科技有限公司)；兔抗鼠ADRB2抗體(上海艾博抗貿易有限公司)，兔抗鼠RANKL 抗體(北京索萊寶科技有限公司)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，SP)超敏試劑盒、酶底物顯色劑DAB(福州邁新生物技術公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組以及大鼠牙移動模型的建立 隨機數字表法將實驗大鼠分為ISO組和對照組，每組25只。以 10%水合氯醛(0.04 ml/g)腹腔注射對大鼠進行全身麻醉，以大鼠兩顆切牙為支抗牙，在大鼠切牙唇側及近遠中備一條連續的固位溝，用0.2 mm的結扎絲經右上第一磨牙與第二磨牙之間的牙間隙穿過，將一螺旋拉簧(直徑0.01 mm，長度6 mm)結扎于上頜的兩切牙固位溝內和右上第一磨牙之間，由正畸測力計測得50 g力值牽引右上第一磨牙。使用粘結樹脂將結扎絲固定于固位溝上，每天檢查裝置脫落情況，每7 d加力1次。正畸牙移動模型建立好后即刻對ISO組腹腔注射ISO[1 mg/(kg·d)]，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，給藥和加力同步開始，每晚定時給藥。

1.3.2Micro-CT觀察異丙腎上腺素作用下大鼠牙齒移動過程中骨微結構的變化 第14天腹腔注射過量50%水合氯醛處死兩組大鼠各5只，取上頜骨，4%多聚甲醛中固定，采用西門子 Inveon micro-PET/CT對處理后的標本進行掃描，掃描范圍為右側上頜第一磨牙、第二磨牙、第三磨牙及周圍牙槽骨組織。用三維測量軟件對掃描后的圖像進行處理，在Micro-CT 掃描圖像中，選擇右側上頜第一磨牙近中根與遠中根間牙槽間隔的牙槽骨為目標區域(圖1)。使用 Inveon micro-PET/CT自帶軟件對選定區域進行三維重建，并對該部分的骨小梁結構參數進行測量。主要測量參數：骨體積分數(BV/TV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數目(Tb.N)。

圖1 目標區域Micro-CT掃描圖像 ×0.68 A：矢狀面；B：水平面；C：垂直面

1.3.3SP法檢測ADRB2及RANKL在大鼠壓力側牙周組織中的表達 在第0(未給藥)、7、14、21天腹腔注射過量50%水合氯醛處死兩組大鼠各5只，取上頜頜骨，完整剪下右側第一磨牙及周圍的牙槽骨，立即放入4%多聚甲醛中固定，24 h后放入EDTA脫鈣液中常規脫鈣3個月。脫鈣完成后，經過各級乙醇溶液脫水。然后置于二甲苯中透明，石蠟包埋。沿牙體長軸進行切片，獲得數張近遠中向連續切片，每張切片厚度大約為3 μm。在各個時間點ISO組、對照組中隨機選擇第一磨牙壓力側牙周組織完整的切片各5張，嚴格依照SP試劑盒說明對大鼠第一磨牙及其周圍牙槽骨標本進行ADRB2以及RANKL免疫組化染色后，將切片置于OLYMPUS正置相差顯微鏡下觀察染色情況；再將切片放于自來水下沖洗，蘇木精復染，PBS溶液沖洗返藍；常規脫水、透明、封片。將切片放入OLYMPUS正置相差顯微鏡觀察，分別在ISO組、對照組的每張染色切片上確定一個部位，即大鼠右側上頜的第一磨牙壓力側牙周膜近牙槽骨區域；在壓力側牙周組織中從牙槽嵴頂到牙根尖部隨機各選取5個目標視野并拍照。采用Image Pro Plus6圖像分析軟件包測量圖像的平均光密度(mean optical density，MOD)。檢測各組標本中ADRB2、RANKL的MOD值。

2 結果

2.1 Micro-CT觀察骨微結構的變化給藥后第14天，ISO組大鼠BV/TV小于對照組，Tb.Sp大于對照組，Tb.N小于對照組，差異有統計學意義(F=38.58，F=24.73，F=18.71，P<0.05)。見表1。

表1 牙槽骨微結構

與對照組比較：*P<0.05

2.2 SP法檢測ADRB2的表達兩組大鼠牙齒及牙周組織中均存在ADRB2陽性表達，ADRB2陽性表現為棕黃色的細胞質與細胞膜，其棕黃色顏色越多表明ADRB2的陽性表達越強。在第0(未給藥)、7、14、21天各組ADRB2的MOD值均呈上升趨勢。給藥后第7、14、21天，ISO組的ADRB2的MOD值均高于對照組(F=20.19,F=14.16,F=6.94,P<0.05)，見表2、圖2、3。

表2 ADRB2的MOD值

與對照組比較：*P<0.05

2.3 SP法檢測RANKL的表達兩組大鼠牙齒及牙周組織中均存在 RANKL ，視野中棕黃色為陽性表達。在第0(未給藥)、7、14、21天，對照組大鼠第一磨牙壓力側牙周組織中RANKL平均光密度值一直呈增長趨勢，ISO組在給藥后第7、14天上升，而第14、21天下降，第14天達到最高峰。給藥后第7、14天，ISO組均高于對照組(P<0.05,F=5.37、8.89),給藥后第21天，ISO組高于對照組(P>0.05,F=3.55)，見表3、圖4、5。

圖2 ISO組ADRB2陽性表達 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

圖3 對照組ADRB2陽性表達 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

表3 RANKL平均光密度值

與對照組比較：*P<0.05

圖4 ISO組RANKL陽性表達 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

圖5 對照組RANKL陽性表達 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

3 討論

在牙槽骨的改建中破骨細胞發揮了重要的作用，活化成熟的破骨細胞和新生破骨細胞的誘導成熟是破骨細胞進行骨吸收的重要前提[4]。在骨改建的各種研究中，破骨細胞的分化與激活一直是研究的重點，破骨細胞的分化和功能發揮受到 OPG/ RANKL/ RANK系統的調節，還受到自主神經系統的調節。實驗研究中大鼠牙移動壓力側RANKL表達量增加，說明異丙腎上腺素促進大鼠牙移動壓力側的破骨活動。

王承勇 等[5]使用外科手術的方法建立了失去交感神經支配的大鼠模型，發現其能有效地抑制頜骨骨吸收，從而證明了交感神經系統確實參加了對頜骨骨代謝的調控。國內外大量的研究[6-9]表明交感神經系統參與骨代謝的調節。實驗研究中大鼠牙移動壓力側ADRB2表達量增加，說明異丙腎上腺素促進大鼠牙移動壓力側交感活性，從而推測ISO可能通過ADRB2刺激破骨細胞的生成。

Micro-CT技術用于骨組織骨微結構的研究，較以往采用的骨形態計量方法，Micro-CT測量出的骨小梁各參數更加精確。Micro-CT成像已被證實與大鼠和人體樣本的骨組織形態計量學分析密切相關[10-11]。采用Micro-CT觀察不同濃度異丙腎上腺素作用下大鼠牙齒移動過程中微觀結構，能夠更加準確地得到牙槽骨骨體積分數、骨小梁分離度以及骨小梁數目等結構參數。