人EBI3及其截短體蛋白在哺乳動物細胞中的分泌

劉澤宇，潘林鑫，李紫陽，馮 成，劉曉穎，范禮斌

EB病毒誘導基因3(epstein-barr virus-induced gene 3，EBI3)作為白介素-6/白介素-12(interleukin-6/interleukin-12，interleukin-6/interleukin-12)細胞因子家族中的重要亞基，最初在被EB病毒感染的B細胞中被確認。EBI3蛋白是分子量為34 ku易于分泌的可溶性細胞因子[1]。EBI3蛋白包含有2個串聯的纖連蛋白Ⅲ型結構域[2]。免疫系統的活化的樹突狀細胞、調節性T細胞和調節性B細胞中均有EBI3的表達和分泌[2-4]

在哺乳動物細胞內，信號肽在蛋白質的經典分泌途徑中發揮了重要作用。此外，哺乳動物細胞內還存在例如由外泌體介導的非經典的蛋白質分泌途徑[5-6]。外泌體是胞內體在成熟過程中產生的微小的(30～150 nm)胞外囊泡[7-8]，通過轉運活性RNA、脂質和蛋白質參與機體內多種生理和病理過程[9-10]。Uniprot數據庫對EBI3的氨基酸序列進行分析表明，其信號肽位于第1～20位氨基酸。該文利用已構建的野生型EBI3及EBI3截短體重組質粒pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG(圖1A)，探究EBI3氨基端的缺失是否影響EBI3蛋白在哺乳動物細胞中的分泌，并對EBI3蛋白能否經由外泌體介導的非經典蛋白分泌途徑分泌至胞外進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與質粒 HEK 293T細胞、真核表達載體pcDNA3.1(+)、重組質粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG與pcDNA3.1-EBI3(125～ 230)-FLAG均為本實驗室保存。

1.1.2試劑 DMEM高糖培養液購自北京賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；細胞裂解液、100×青霉素-鏈霉素工作液購自上海碧云天公司； PVDF膜購自加拿大Bio Basic公司；預染蛋白質marker購自美國Thermo公司；PMSF、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；LipofectamineTM2000、Opti-MEM reduced serum medium購自美國Invitrogen公司；FLAG單克隆抗體購自美國Sigma公司；CD9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech Group公司； SuperSignal West Pico顯色試劑盒購自美國Pierce公司； ExoQuick-TCTM外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HEK 293T細胞系的培養液為高糖型DMEM，并加入10%的胎牛血清(配制培養基的用具經過嚴格的滅菌處理)，培養箱環境為37 ℃、5% CO2，細胞生長至匯合度為80%～90%時傳代。

1.2.2重組質粒的瞬時轉染 轉染前16～24 h，對HEK 293T細胞進行傳代，以(1～2)×105/cm2的密度接種于所需的培養皿中，待細胞長至80%～90%匯合度時進行轉染實驗，轉染重組質粒的量(μg)與所需LipofectamineTM2000的體積(μl)之間的比例為1 ∶1.5～1 ∶2。

1.2.3裂解細胞以及Western blot檢測蛋白表達 轉染36～48 h后，收集細胞，用適量的Western細胞裂解液(用前加PMSF)裂解細胞并用Bradfrod試劑進行蛋白定量，加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5～10 min，冰水浴3 min后，用預先配制的15% SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 電泳30 min后110 V電泳70 min)；電泳結束后，270 mA恒流濕轉1 h；取出PVDF膜，用封閉液(含5%脫脂奶粉的1×TBST溶液)室溫封閉2 h，相應一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后顯影。

1.2.4SBI ExoQuick-TCTM試劑盒提取外泌體 收集細胞培養液4 ℃、 5 000 r/min離心15 min去除細胞和細胞碎片，將細胞培養液轉移到無菌的15 ml離心管中，并向其中加入適當體積的ExoQuick-TC(細胞培養液體積： ExoQuick-TC體積=5 ∶1)，通過顛倒離心管或輕彈管壁使二者充分混合，4 ℃ 孵育過夜，離心管在孵育時應保持直立，孵育后4 ℃、 1 500 r/min離心30 min，棄上清液，4 ℃、 1 500 r/min離心5 min棄去剩余上清液，用1×PBS重懸外泌體沉淀，加入適量5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5～10 min，冰水浴3 min，進行Western blot檢測。

2 結果

2.1 野生型EBI3及其截短體蛋白EBI3(1～135)、EBI3(125～230) 在HEK 293T細胞中的表達分別將pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG重組質粒轉染至HEK 293T細胞中，轉染48 h后收集細胞，裂解細胞并定量，對細胞總蛋白進行Western blot檢測。結果表明，轉染了上述重組質粒的HEK 293T細胞裂解液中均能檢測到相應蛋白分子量的條帶。野生型EBI3蛋白分子量約為33 ku，EBI3(1～135)和EBI3(125～230)蛋白分子量分別約為15 ku和12 ku，表明野生型EBI3及其截短體蛋白在HEK 293T細胞中均能正常表達，見圖1。

圖1 EBI3及其截短體蛋白在HEK 293T細胞中的表達

A：野生型EBI3及其截短體重組質粒示意圖；B：EBI3及其截短體蛋白在HEK 293T細胞中表達;1～4：分別轉染了pcDNA3.1、pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的細胞裂解液

2.2 野生型EBI3及其截短體蛋白EBI3(1～135)、EBI3(125～230)在HEK 293T細胞培養液中的表達將pcDNA3.1-EBI3-FLAG重組質粒轉染至HEK 293T細胞中，轉染48 h后收集細胞培養液，5 000 r/min離心10 min，加入5×SDS上樣緩沖液并進行Western blot檢測，結果表明，轉染了pcDNA3.1-EBI3-FLAG的HEK 293T細胞培養液中能檢測到相應的EBI3蛋白的條帶，見圖2A。

將pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG重組質粒轉染至HEK 293T細胞中，轉染48 h后收細胞培養液，5 000 r/min離心10 min并對細胞培養液進行Western blot檢測，結果表明，轉染了pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG的HEK 293T細胞的培養液中能夠檢測到相應的EBI3(1～135)蛋白；但轉染了pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的細胞培養液中則不能檢測到EBI3(125～230)蛋白，見圖2B。上述的實驗結果表明，野生型EBI3蛋白能夠分泌至細胞外，且在哺乳動物細胞中EBI3蛋白氨基端的缺失會抑制EBI3蛋白的分泌。

圖2 EBI3及其截短體蛋白在HEK 293T細胞培養基上清中的檢測

A：EBI3蛋白在HEK 293T細胞培養基上清中的檢測; B：EBI3截短體蛋白在HEK 293T細胞培養基上清中的檢測;1、2：分別轉染pcDNA3.1與 pcDNA3.1-EBI3-FLAG的細胞裂解液；3、4：分別轉染pcDNA3.1、 pcDNA3.1-EBI3-FLAG的細胞培養液；1～3：分別轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的細胞裂解液；4～6：分別轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、 pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的細胞培養液

2.3 野生型EBI3及其截短體蛋白EBI3(1～135)、EBI3(125～230)在外泌體中的表達在上述分泌實驗結果的基礎上，進一步嘗試在轉染了pcDNA3.1-EBI3-FLAG的HEK 293T細胞的外泌體中對EBI3蛋白進行檢測。將pcDNA3.1-EBI3-FLAG重組質粒轉染至HEK 293T細胞中，轉染48 h后收細胞培養液，5 000 r/min離心10 min后取上清液，用SBI ExoQuick-TCTM試劑盒提取細胞培養液中的外泌體進行Western blot檢測，結果見圖3A，轉染了pcDNA3.1-EBI3-FLAG的HEK 293T細胞的外泌體中能夠檢測出EBI3蛋白的條帶。同樣的，分別在轉染了 pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的HEK 293T細胞的外泌體中檢測相應的EBI3截短體蛋白，轉染48 h后收細胞培養液，5 000 r/min離心10 min后提取外泌體，進行Western blot檢測，結果見圖3B，表明轉染了pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG重組質粒的HEK 293T細胞的外泌體中均不能檢測到EBI3的截短體蛋白EBI3(1～135)和EBI3(125～230)。上述結果顯示，EBI3能夠通過外泌體介導的非經典蛋白分泌途徑分泌至細胞外，而EBI3氨基端或羧基端的缺失都會阻礙該分泌過程。

圖3 EBI3及其截短體蛋白在哺乳動物細胞外泌體中的檢測

A：EBI3蛋白在哺乳動物細胞外泌體中的檢測；B：EBI3截短體蛋白在哺乳動物細胞外泌體中的檢測；1、2：分別轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-EBI3-FLAG的細胞培養液；3、4：分別轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-EBI3-FLAG后提取的外泌體；1～3：轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG的細胞培養液；4～6：轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG后提取的外泌體

3 討論

EBI3蛋白在人的免疫系統中發揮重要作用，其作為IL-6/ IL-12細胞因子家族成員的β-亞基分別與p28、p35及p19結合形成IL-27、IL-35及IL-39。在肺癌患者中，EBI3的高表達與預后不良相關，并且肺癌患者血清EBI3水平明顯升高，胃癌的發生與發展也與EBI3有一定的關聯[11]。近年研究[12]表明EBI3除了以IL-6/IL-12細胞因子家族的亞基的形式發揮其生物學共功能外，也可能以單體或者同二聚體的形式存在而發揮作用，系統性硬化皮膚與正常皮膚角質細胞和真皮的調節性T細胞相比，EBI3的表達量被證明是減少，但IL-35和IL-27并不會有明顯變化，雖不排除EBI3與其他分子形成絡合物的可能，但EBI3本身可能直接影響了膠原蛋白的表達。

鑒于本課題組在之前的研究[13]中構建了分別包含氨基端或羧基端 FN3結構域的EBI3的截短體重組質粒pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG，并研究了EBI3截短體蛋白在哺乳動物細胞中的定位，結合對EBI3氨基酸序列的分析，推測EBI3的氨基端的信號肽對EBI3在胞內的定位和分泌起著重要作用，本研究關注EBI3蛋白在哺乳動物細胞中的分泌情況，旨在探究 EBI3蛋白氨基端和羧基端的缺失對EBI3蛋白分泌的影響，分別轉染pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG與pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG重組真核表達質粒至HEK 293T細胞中，對轉染后的細胞裂解液以及細胞培養液進行Western blot檢測， 結果表明，細胞培養液中未檢測到EBI3氨基端缺失的截短體蛋白，提示EBI3蛋白的氨基端信號肽序列對EBI3的分泌具有重要的調控作用，該蛋白的信號肽通過預測以及其他文獻的報道應該是明確的。除了由信號肽參與的經典蛋白分泌途徑，本文進一步探究EBI3蛋白能否經由外泌體介導的非經典蛋白分泌途徑分泌至胞外，Western blot的結果表明，EBI3蛋白能夠通過該途徑分泌至細胞外，而EBI3氨基端缺失與羧基端缺失的截短體蛋白均無法通過該途徑分泌至細胞外，提示EBI3氨基端與EBI3羧基端上均存在參與這一蛋白質非經典分泌途徑的結構域，而EBI3能夠通過這一途徑分泌至細胞外可能與外泌體中存在的受體gp130相關[14]，這值得做進一步的探究。此外，通過不同的蛋白質分泌途徑分泌至細胞外的EBI3蛋白的功能上是否存在差異也值得進行深入研究。研究過程中發現外泌體中EBI3蛋白的分子量較培養液中明顯減小，這種分子量變化是否與糖基化修飾有關，值得商榷。上述實驗為本課題組后續開展EBI3相關的功能實驗奠定了一定的基礎。