miR-637調(diào)控CDK6/cyclinD1/Rb信號通路對人胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

劉玉海，劉明明，劉新華

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。在我國，胃癌發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第三位和第五位，近年來仍有上升趨勢[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素參與的復雜過程，其發(fā)病機制尚不完全明確。microRNA(miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，通過與靶基因的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯或促進降解，從而起到調(diào)控靶基因表達的作用。大量研究[3-5]表明，miRNA直接或間接參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。miR-637在肝癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、甲狀腺癌[8]等腫瘤細胞中表達下調(diào)，過表達miR-637可以抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。表明miR-637可能是一個腫瘤抑制因子。但miR-637對胃癌細胞的影響尚不明確。本文擬研究miR-637在人低分化胃腺癌細胞系A(chǔ)GS、中分化胃腺癌細胞系SGC-7901和正常胃黏膜上皮細胞系GES-1中的表達水平，探討miR-637對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌細胞系SCG7901、AGS和人胃黏膜上皮細胞系GES-1均購自美國ATCC細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗購自美國Hyclone公司；CCK-8增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；miR-637 mimics、抑制劑、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、RNA 提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Western blot所用的CDK6、cyclin D1、E2F1、Rb、β-actin一抗均購自美國Proteintech公司；磷酸化Rb一抗、二抗購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染胃癌細胞系SCG7901、AGS和胃黏膜上皮細胞GES-1，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至匯聚度達到95%時傳代。細胞轉(zhuǎn)染時，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作方法，用Lipofectamine 2000分別將miR-637 mimics及陰性對照miR-NC、miR-637 inhibitor及陰性對照IN-NC轉(zhuǎn)入AGS和SCG7901細胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用實時定量PCR(qRT-PCR)鑒定轉(zhuǎn)染效率，并進行后續(xù)功能實驗。

1.3 RNA提取及qRT-PCR根據(jù)RNA提取試劑盒的說明書，用TRIzol試劑提取各組細胞中的總RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)說明書進行熒光定量PCR擴增，以U6 RNA和GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法將Ct值結(jié)果進行處理，對miR-637和CDK6 mRNA相對表達水平進行定量分析。各基因引物見表1。

1.4 細胞增殖實驗各組細胞用胰蛋白酶消化，吹打成單細胞懸液。細胞計數(shù)后，以每孔2 000個接種于96孔板，每孔200 μl培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，按20 μl/孔加入CCK-8溶液，2 h后在振蕩器上振蕩15 min，用酶標儀檢測450 nm的吸光度，以時間(d)為橫坐標，吸光度值(OD)為縱坐標，繪制出各組細胞生長曲線。

表1 各基因qRT-PCR引物一覽表

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將各組細胞接種于6孔板中，待細胞匯聚度達到100%后，用滅菌槍頭在單層細胞層上用力劃線，劃痕后0 h和48 h分別在顯微鏡下觀察細胞劃痕的恢復情況并拍照。用圖像分析軟件分析細胞劃痕寬度并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h)/劃痕寬度0 h×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲能力各組細胞消化后吹打成單細胞懸液。細胞計數(shù)后，按5×104個/孔的密度接種到預先加入matrigel的transwell小室中，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)層細胞。小室下層細胞用無水甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色，每孔隨機選取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計。實驗重復3次，取平均值，計算抑制率。

1.7 Western blot用Western blot及IP細胞裂解液將各組細胞裂解，提取細胞中總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用10% SDS-PAGE電泳，每孔泳道加入30 μg總蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(用一抗稀釋液1 ∶1 000稀釋)，4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min。加入TBST 1 ∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。采用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)進行顯影檢測蛋白條帶，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-637在胃癌細胞系中低表達用qRT-PCR檢測了正常胃黏膜上皮細胞系GES-1和胃癌細胞系A(chǔ)GS、SGC7901中miR-637的表達量。結(jié)果如圖1所示，與正常胃黏膜細胞GES-1相比，miR-637在胃癌細胞SGC7901和AGS中的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.63,P<0.01;t=15.88,P<0.01)。

圖1 miR-637在胃癌細胞中的表達與GES-1細胞比較：**P<0.01

2.2 miR-637抑制胃癌細胞增殖在胃癌細胞系SGC7901和AGS中轉(zhuǎn)入miR-637 mimics、inhibitor以及陰性對照miR-NC、IN-NC后，用qRT-PCR鑒定miR-637的相對表達量，以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimics的SGC7901和AGS細胞相對表達量均顯著高于陰性對照組miR-NC，差異有統(tǒng)計學意義(t=-21.96,P<0.01;t=-21.32,P<0.01)(圖2A)。轉(zhuǎn)染inhibitor的SGC7901和AGS細胞相對表達量均顯著低于陰性對照組IN-NC(圖2B)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.67,P<0.05；t=4.89,P<0.05)。PCR結(jié)果表明在細胞內(nèi)過表達miR-637和降低miR-637表達量成功，轉(zhuǎn)染后的細胞系可以進行后續(xù)功能研究。

用CCK-8試劑盒檢測miR-637 mimics和inhibitor對胃癌細胞增殖的影響。結(jié)果如圖3所示，在人胃癌細胞SGC7901、AGS中轉(zhuǎn)入mimics后，OD值低于轉(zhuǎn)入陰性對照(miR-NC)的細胞，表明細胞增殖水平降低，第3天之后兩組細胞的OD值差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A、3B)；而轉(zhuǎn)入inhibitor后，OD值高于轉(zhuǎn)入陰性對照(IN-NC)的細胞，表明細胞的增殖能力增強，第2天之后兩組細胞OD值差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3C、3D)。細胞增殖實驗的結(jié)果表明，miR-637作為抑癌基因抑制胃癌細胞的增殖。

圖2 細胞中miR-637過表達和抑制的驗證

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后miR-637相對表達水平；與miR-NC組比較：**P<0.01；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后miR-637相對表達水平；與IN-NC組比較：#P<0.05

圖3 miR-637對胃癌細胞增殖的影響

A、B：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后細胞生長曲線；與miR-NC組比較：*P<0.05；C、D：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后細胞生長曲線；與IN-NC組比較：#P<0.05

2.3 miR-637抑制胃癌細胞的遷移能力用劃痕愈合實驗檢測了轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和inhibitor對兩株胃癌細胞遷移能力的影響。SGC7901細胞轉(zhuǎn)入mimics后，劃痕愈合率為(33.3%±3.7%)，轉(zhuǎn)入陰性對照miR-NC為(60.4%±4.2%)；AGS細胞轉(zhuǎn)入mimics后，劃痕愈合率為(28.6%±3.4%)，轉(zhuǎn)入miR-NC為(55.3%±4.8%)(圖4A)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.84,P<0.01；t=7.86,P<0.01)。SGC7901細胞轉(zhuǎn)入inhibitor后，劃痕愈合率為(78.9%±7.5%)，轉(zhuǎn)入陰性對照IN-NC為(53.1%±6.7%)；AGS細胞轉(zhuǎn)入inhibitor后，劃痕愈合率為(89.4%±16.1%)，轉(zhuǎn)入IN-NC為(37.1%±3.7%)(圖4B)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.44,P<0.05；t=-5.48,P<0.05)。劃痕實驗的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入mimics抑制了細胞的遷移，而轉(zhuǎn)入inhibitor促進了細胞的遷移，提示miR-637可以抑制胃癌細胞的遷移能力。

圖4 miR-637對胃癌細胞遷移能力的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后細胞劃痕愈合情況；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后細胞劃痕愈合情況

2.4 miR-637抑制胃癌細胞的侵襲能力進一步用Transwell實驗檢測了miR-637 mimics和inhibitor對兩株胃癌細胞侵襲能力的影響。在顯微鏡200倍視野下對侵襲穿過小室的細胞進行計數(shù)。SGC-7901細胞轉(zhuǎn)入mimics后，穿過小室的細胞數(shù)為(35.1±4.8)個，轉(zhuǎn)入miR-NC為(27.3±1.4)個；AGS細胞轉(zhuǎn)入mimics的為(20.9±2.3)個，轉(zhuǎn)入miR-NC的為(14.1±2.0)個(圖5A)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.48,P<0.05；t=4.98,P<0.05)。SGC-7901細胞轉(zhuǎn)入inhibitor的為(32.6±3.0)個，轉(zhuǎn)入IN-NC的為(44.3±5.4)個；AGS細胞轉(zhuǎn)入inhibitor的為(15.7±2.3)個，轉(zhuǎn)入IN-NC的為(24.7±3.1)個(圖5B)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.28,P<0.05;t=-4.03,P<0.05)。Transwell實驗的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入mimics減少了侵襲的細胞數(shù)，而轉(zhuǎn)入inhibitor增加了侵襲的細胞數(shù)，提示miR-637可以降低胃癌細胞的侵襲能力。

2.5 miR-637抑制CDK6/cyclinD1/Rb信號傳導通路本研究采用qRT-PCR和Western blot兩種方法分別檢測了miR-637對CDK6 mRNA和蛋白表達量的影響，結(jié)果如圖6A、6B所示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-637 mimics的SGC7901和AGS細胞中CDK6 mRNA表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.32,P<0.05；t=5.08,P<0.05)。與轉(zhuǎn)染IN-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor的SGC7901和AGS細胞中CDK6 mRNA相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.65,P<0.01；t=-6.18,P<0.05)。

圖5 miR-637對胃癌細胞侵襲能力的影響 結(jié)晶紫染色×200

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后穿過transwell小室的細胞；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后穿過transwell小室的細胞

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染mimics降低了SGC-7901和AGS細胞中CDK6的表達水平，而轉(zhuǎn)染inhibitor上調(diào)了CDK6的表達(圖6C)。進一步用Western blot實驗檢測了miR-637 mimics和inhibitor對CDK6下游信號通路的影響。結(jié)果如圖6D所示，與miR-NC相比，轉(zhuǎn)染mimics能下調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclin D1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達以及Rb的磷酸化水平，對Rb的表達水平?jīng)]有顯著影響。而轉(zhuǎn)染inhibitor能增加cyclin D1、E2F1的表達和Rb的磷酸化水平。上述結(jié)果表明，miR-637可以抑制CDK6/cyclinD1/Rb信號傳導通路。

圖6 miR-637對CDK6/cyclinD/Rb和E2F1信號通路的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后CDK6 mRNA的相對表達水平；與miR-NC組比較：*P<0.05；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后CDK6 mRNA的相對表達水平；與IN-NC組比較：#P<0.05，##P<0.01；C、D：Western blot檢測CDK6和下游信號分子的變化情況；1：SGC7901 miR-NC組；2：SGC7901 mimics組；3：SGC7901 IN-NC組；4：SGC7901 inhibitor組；5：AGS miR-NC組；6：AGS mimics組；7：AGS IN-NC組；8：AGS inhibitor組

3 討論

胃癌是一種具有侵襲性的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移率高，導致胃癌患者5年生存期較低，僅30%～35%[9]。癌癥的發(fā)生發(fā)展是多種促癌和抑癌基因表達異常、信號傳導通路調(diào)控失常的綜合結(jié)果。因此，深入研究闡明胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因和信號分子，對于發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點、開發(fā)早期診斷標志物和靶向治療藥物都具有重要意義和應用價值。miRNAs與靶基因mRNA的3′-UTR通過堿基互補配對結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達，從而促進或者抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和對藥物的敏感性。研究證實，多種miRNA與胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力有密切關(guān)系，例如miR-23a/b通過調(diào)控PDCD4促進了胃癌細胞的生長、抑制細胞凋亡[10]；miR-125a通過調(diào)控STAT3抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[11]；miR-362-5p在胃癌組織中表達量高于癌旁組織，并在體外促進了胃癌細胞的增殖和遷移[12]，但miR-637與胃癌的關(guān)系尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜細胞相比，胃癌細胞系SGC7901和AGS中miR-637的表達量顯著降低。在胃癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-637 mimics可顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，而轉(zhuǎn)染inhibitor則促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，說明miR-637是胃癌發(fā)生發(fā)展的抑制因子。

CDK6是重要的細胞周期調(diào)控因子。CDK6與細胞周期蛋白cyclin D1形成復合體而激活，激活后的復合體通過磷酸化下游腫瘤抑制因子Rb導致其失活，同時上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達，今后推動細胞周期的轉(zhuǎn)換，促進細胞增殖[13]。CDK6的過表達與非小細胞型肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)，已成為抗腫瘤藥物的作用靶點[14]。

有文獻[15]報道，在慢性阻塞性肺病中，缺氧導致miR-637下調(diào)，從而增加下游靶基因CDK6在肺部平滑肌細胞中的表達，導致肺動脈高壓，表明miR-637可以調(diào)控CDK6的表達。因此，在本研究中檢測了胃癌細胞過表達和沉默miR-637時CDK6 mRNA和蛋白水平的變化情況。結(jié)果表明，過表達miR-637可顯著下調(diào)CDK6的表達，同時降低cyclin D1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達，抑制Rb的磷酸化，從而抑制細胞增殖、遷移和侵襲。