艾灸對實驗性RA家兔Th17/Treg平衡的影響?

高秀花，劉旭光，晉 松，楊慎峭，周海燕，楊 馨，賈 敏

(1.成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072；2.成都中醫藥大學，成都 610075；3.包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古 包頭 014000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，主要由T淋巴細胞介導，RA病因及發病機制復雜，纏綿難愈，屬國內外廣泛關注的疑難疾病。RA發病機制主要是CD4+T淋巴細胞分化異常，既往研究認為輔助性T細胞1(T helper cells 1，Th1)/輔助性T細胞2(T helper cells 2，Th2)平衡在RA的發生發展中發揮著重要作用[1]。然而隨著研究的深入和輔助性T細胞17(T helper cells 17，Th17)、調節性T細胞(Regulatory T cells，Treg)的發現，人們認識到Th17/Treg失衡在RA的發生發展中至關重要，且RA存在向Th17方向偏離的現象[2]。因此以Treg/Th17為靶點治療RA的研究逐漸受到關注，如獲得臨床滿意療效的抗IL-17 A 和IL-17RA抗體的研究，但其不良反應不可忽視[3]。

艾灸治療RA安全無毒副作用，抗炎及免疫調節作用確切，但艾灸能否影響RA中Th17/Treg平衡尚未見報道。為進一步闡釋艾灸的科學內涵和作用機理，我課題組基于前期課題研究，從艾灸治療RA的抗炎作用出發，以Th17/Treg平衡為切入點，運用ELISA、RT-PCR等技術，從對Th17/Treg細胞相關細胞因子白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)/白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)以及Th17/Treg細胞關鍵轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt(Retinoid related orphan receptor，RORγt)/叉頭樣轉錄因子P3(Foxhead box protein 3，Foxp3)表達的影響，分別探索艾灸對RA中 Th17/Treg平衡的影響，以期更加深入地揭示艾灸的作用機理。

1 材料

1.1 動物

日本大耳白兔30只(動物、飼料均由成都中醫藥大學動物實驗中心提供，批號SCXK(川)2008-14，合格證號川實動管字089號)，雌雄各半，體質量(2.5±0.25)kg，實驗過程中所有處置符合相關動物倫理學要求。

1.2 主要試劑及儀器

弗氏完全佐劑Sigma公司(貨號Lot101M8711)；兔IL-17、IL-10 ELISA試劑盒(Abcam公司，貨號分別為DRE95204、DRE95029)；總RNA抽提試劑(Invitrogen公司，批號15596-026)；酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司，型號Multlskan Mk3)；RT-PCR儀(ThermoFisher儀器有限公司，型號PIKORed 96)；電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY200C)；RT-PCR反應試劑盒、RNA提取及反轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司，批號分別為BK402、BK3303、BK501)；艾粒(中國南陽東升艾灸廠，規格Ф6.8×26 mm，批號2014032)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備

適應性馴養家兔7 d后，將家兔按隨機數字表法分為空白對照組(簡稱“空白組”)、RA模型組(簡稱“模型組”)、艾灸治療組(簡稱“治療組”)3組各10只。

選用RA經典動物模型造模：馴養7 d后，將治療組、模型組家兔雙側后膝關節剃毛暴露，10%異丙醇進行皮膚消毒，輕度屈曲膝關節，定位膝關節髕骨下緣、髕韌帶外側凹陷為穿刺點，按0.5 ml/kg體質量劑量將弗氏完全佐劑平均注入家兔雙側后膝關節腔內，同法空白組家兔注入無菌生理鹽水[4]。

2.2 治療

于造模后1周將治療組家兔固定在兔架上，暴露施灸部位(每處剃毛約2×2 cm2)，參照《實驗針灸學》[5]的動物穴位圖譜，將艾粒黏貼于雙側“足三里”“腎俞”穴，每穴連續施灸5壯，每日1次，6 d為1個療程，療程期間休息1 d，共治療3個療程。空白組和模型組同法抓取固定，但不施灸。3組同步，操作均在上午9∶00～11∶00之間進行。

2.3 膝關節周長測定

分別于造模前后及治療第1、2、3周測定所有家兔的左右后肢膝關節周長，測量使用軟尺過膝關節髕骨下緣、髕韌帶外側凹陷的穿刺點。

2.4 取樣及指標檢測

治療第3周結束(治療第21天)，于9∶00～11∶00間進行標本采集。

2.4.1 滑膜液抽取及相關指標檢測 耳緣靜脈注射空氣處死家兔，分別在雙側膝關節腔內注射生理鹽水0.3 ml，輕揉局部后無菌條件下抽吸關節腔中滑膜液約0.3 ml裝入EP管，-20 ℃低溫保存。根據試劑盒說明書，運用ELISA雙抗夾心法測定滑膜液量中IL-10、IL-17，并計算IL-10/IL-17比值。

2.4.2 滑膜組織取材及相關指標檢測 抽取滑膜液后，沿著雙后膝關節正中線縱行剖開皮膚，直至暴露以膝關節為中心的區域大小約為3×3 cm2，使用齒鑷提起髕骨，沿髕骨上緣大約0.3～0.4 cm處向下切至股骨，再沿髕骨兩側向下分離到脛骨，肉眼可見一層淡黃色滑膜組織自髕骨下緣向上延續。完全暴露滑膜組織，用眼科鑷輕夾其游離端，使用刀片完整切下，-70 ℃保存待測。運用RT-PCR法測定滑膜組織中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表達量，并計算Foxp3/RORγt比值。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 艾灸對實驗性RA家兔膝關節周長影響

表1 3組家兔雙側膝關節周長比較

注:與空白組比較:**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01

表1顯示,造模前，各組家兔雙側膝關節周長比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性；造模后，模型組、治療組雙側膝關節周長均較空白組有明顯升高(P<0.01)，而2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，說明造模成功。治療第1、2、3周，模型組雙側膝關節周長較空白組均明顯升高(P<0.01)，而治療組較模型組均明顯降低(P<0.01)。

3.2 艾灸對實驗性RA家兔滑膜液Th17/Treg相關細胞因子IL-17/IL-10含量以及滑膜組織Th17/Treg關鍵轉錄因子RORγt/Foxp3表達的影響

表2顯示,與空白組比較，模型組滑膜液中IL-10含量偏低(P<0.05)，IL-17含量明顯偏高(P<0.01)，IL-10/IL-17值明顯偏低(P<0.01)；滑膜組織中Foxp3mRNA的表達存在下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，RORγtmRNA表達則升高(P<0.05)，Foxp3/RORγt值降低(P<0.05)。與模型組比較，治療組IL-10含量偏高(P<0.05)，IL-17含量偏低(P<0.05)，IL-10/IL-17值偏高(P<0.05)；Foxp3mRNA表達存在升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；RORγtmRNA表達降低(P<0.05)，Foxp3/RORγt值存在升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 3組家兔滑膜液中IL-10、IL-17含量及滑膜組織中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表達量比較

注：與空白組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05

4 討論

RA屬于系統性、自身免疫性疾病，其病因及其發病機制尚不明確[6]。滑膜炎癥為主要病理改變，其臨床表現為對稱性發生的多關節炎，表現為局部紅、腫、熱、痛。因此，本實驗選擇測量日本大耳白兔的膝關節周長，從宏觀角度判斷炎癥程度。根據實驗結果，本研究造模成功，通過對3組家兔的充分比較說明艾灸具有明顯的消腫和抗炎作用。

隨著現代免疫學的不斷發展，大量的研究發現，Th17/Treg失衡存在于包括RA在內的多種自身免疫性疾病中，且此平衡有向Th17方向偏離的現象，以Th17/Treg平衡為靶點對RA治療的研究也越來越受到關注。Park和Harrington于2005年首次提出“Th17細胞”的概念，它是在轉錄因子RORγt調控下以分泌IL-17為主要特點的新型Th細胞亞群，是重要的致炎細胞[7-8]；Sakaguchi于上世紀90年代首先提出Treg的概念，是一群具有免疫負性調節功能的CD4+T細胞[9]，主要通過分泌IL-10抑制炎癥反應，特異性表達轉錄因子Foxp3，可以降低RORγt表達，從而抑制Th17細胞功能。Treg細胞與Th17細胞的生物學作用既相互拮抗又相互關聯，保持動態平衡，對正常免疫應答的維持、防止自身免疫性疾病的發生具有非常重要的意義。因此，糾正Th17/Treg失衡狀態將會成為RA治療的新思路和新方法。

RA屬于中醫學“痹癥”范疇，“內外相合”因而致痹，因此其病機關鍵是邪正交爭中的邪侵與正虛[10]，病性屬于“虛實夾雜”或“本虛標實”，致機體經絡閉阻，不榮則痛或不通則痛。《靈樞·官能》中“針所不為，灸之所宜”是對灸法的高度評價，并善于溫經通絡止痛、扶陽補腎固本。故本實驗治療同樣選用先后天之本同固的“腎俞”“足三里”穴，共奏溫腎健脾、補益氣血、活血化瘀、疏通經絡標本同治之效[11]。

已有大量臨床及基礎研究證實，RA的治療中艾灸療效確切，具有明顯的抗炎及免疫調節作用。如艾灸能明顯改善Th1/Th2細胞因子失衡[12]、胸腺萎縮和脾臟腫大等免疫紊亂狀態，明顯抑制滑膜炎癥和滑膜細胞分泌炎癥介質、細胞因子[13-14]等。本實驗著重觀察艾灸對實驗性RA Th17/Treg平衡的影響，研究發現模型組滑膜液中IL-10含量低于空白組，IL-17則明顯升高，IL-10/IL-17值明顯降低，提示RA中存在Th17/Treg細胞因子失衡，且有向Th17方向偏離的現象；治療后IL-10含量高于模型組，IL-17則降低，IL-10/IL-17值亦升高。提示艾灸能夠有效升高實驗性RA滑膜液中異常降低的IL-10水平，降低異常升高的IL-17水平，升高異常降低的IL-10/IL-17比值，從而有效調整Th17/Treg相關細胞因子平衡。與空白組比較，模型組滑膜組織Foxp3mRNA表達有下降趨勢(但差異無統計學意義)，RORγtmRNA表達則升高，Foxp3/RORγt比值降低，提示實驗性RA中存在Th17/Treg關鍵轉錄因子表達失衡，且有向Th17方向偏離的現象；治療后Foxp3mRNA表達有升高趨勢(但差異無統計學意義)，RORγtmRNA表達則降低，Foxp3/RORγt比值有升高趨勢(但差異無統計學意義)。提示艾灸能夠有效升高異常降低的Foxp3表達水平，降低RORγt的異常高表達，可能使異常降低的Foxp3/RORγt比值升高，從而有效調整Th17/Treg細胞關鍵轉錄因子平衡。

綜上所述，本實驗認為艾灸對實驗性RA具有確切的抗炎效應，可調節實驗性RA的 Th17/Treg平衡，這可能就是艾灸抗炎作用的重要機制之一。因實驗當時Th17、Treg細胞相關抗兔流式抗體生產滯后，本課題未能使用流式細胞術檢測，今后條件成熟，可以直接運用流式細胞術等檢測技術，對Th17、Treg細胞的理化特性進行檢測，可更加直接準確地研究艾灸對Th17/Treg平衡的影響。