冠心II號對抑郁聯合高脂大鼠行為及海馬BDNF的影響?

鄭 飛，張學婭，俸一然，饒宇東，許東云，張 穎

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明 650032)

現代社會冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)合并抑郁癥的患者比例逐年增加[1]。文獻報道，住院的CHD患者有17%～27%合并有抑郁癥[2]，CHD合并抑郁癥的患者心腦血管疾病死亡率較一般CHD患者增加1.6倍[3]。這契合了胡大一教授“雙心醫學”中提出的“雙心”患者狀況[4]，因此同時治療CHD和抑郁癥具有重要意義。

中醫“腦心同治”理論指出，對于相同病因病機的心腦疾病宜選用相同的治療方藥，可取得同樣的療效。本課題認為，抑郁癥(郁證)和CHD(胸痹)的中醫共同病機為氣滯血瘀。冠心II號(guanxin II，GXII)作為活血化瘀療法的代表方藥，除具備CHD治療作用外[5]，可能具備抗抑郁作用。本實驗以GXII為研究工具，通過慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯合孤養方法和高脂飲食誘導大鼠抑郁高脂模型，探討GXII除具備治療CHD作用外，是否具備抗抑郁樣作用及其可能機制。

1 材料

1.1 動物

Wistar雄性SPF級大鼠98只，體質量(180～220)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(湘)2013-0004)，飼養于昆明醫科大學動物部動物房。

1.2 藥物及飼料

鹽酸氟西汀，Patheon France 公司(禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號0713B)；維生素D3注射液，上海通用藥業股份有限公司(批號121113)；GXII湯劑，中藥材由昆明市中醫院中藥房提供，昆明市中醫院中藥制劑室制備，生藥濃度1.0 g/ml。高脂大鼠飼料按3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料的比例制備，北京博泰宏達生物技術有限公司。

1.3 試劑

RIPA裂解液，上海碧云天生物技術有限公司(貨號P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司(貨號P0012S)；ECL顯色液，Millipore公司(貨號WBKLS0500)；腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗體，Abmart公司(貨號AB108319)；HRP標記通用型二抗，Abmart公司(CST公司分裝，貨號7074S)；β-actin抗體，Proteintech公司(貨號20536-1-AP)。

1.4 儀器

SMART3.0動物行為學視頻采集與分析系統，Panlab公司；Any-maze動物行為分析系統，Stoelting公司。低溫離心機，Hitachi公司(型號CF-16RX)；紫外可見分光光度計，Hitachi公司(型號U-3010)；酶標儀，Molecular公司(型號PECTRA MAX190)；凝膠成像儀，BIO-RAD公司(型號Chemical xps+)；HE全自動染色機，MICROM公司(型號HMS760X)；顯微鏡，Olympus Corporation公司(型號BX43)；顯微照相機，Canon公司(型號EOS600D)。

2 方法

2.1 分組

大鼠實驗室適應性喂養1周后開始分組實驗，將大鼠按隨機數字表法分為7組各14只，分別為抑郁氟西汀組(depress fuxio DF組)、抑郁GXII組、抑郁模型組、抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組、抑郁高脂模型組和空白對照組。

2.2 動物模型建立

抑郁氟西汀組、抑郁GXII組和抑郁模型組：大鼠CUMS聯合孤養方法造模，給予正常飲食；抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組和抑郁高脂模型組：大鼠CUMS聯合孤養方法造模，同時給予高脂飲食，并在給予高脂飼料前一次性腹腔注射維生素D3注射液(60萬IU/kg)；空白對照組：無特殊處理，給予正常飲食，各組造模均連續8周。

2.3 給藥方法

抑郁氟西汀組、抑郁高脂氟西汀組給予鹽酸氟西汀(3.5 mg/kg)混懸液灌胃，抑郁GXII組、抑郁高脂GXII組給予GXII(2.5 g/kg)中藥湯劑灌胃，抑郁模型組、抑郁高脂模型組、空白對照組給予生理鹽水(2.5 g/kg)灌胃，各組給藥均連續15 d。

2.4 曠場實驗

測定時間為大鼠末次給藥24 h后，采用SMART3.0動物行為學視頻采集與分析系統。敞箱為方形100×100×40 cm大小，由木板制成，內壁及底面均為黑色。將單只大鼠放于清潔敞箱內，記錄5 min內大鼠活動總距離。每天每只大鼠僅測量1次，1只大鼠測量后待徹底清潔敞箱后再進行下只大鼠測量。每只大鼠連續測量7 d，取最后3 d均值進行統計分析。

2.5 強迫游泳實驗

測定時間為大鼠末次給藥24 h后，采用Any-maze動物行為分析系統。水箱為圓形100×50 cm大小，由塑料制成，內壁及底面均為黑色。將單只大鼠放于20 cm水深的水箱內，使其后肢不能觸及底部形成支撐。實驗包括兩階段，大鼠先預游3 min，再記錄之后5 min內大鼠不動時間。每天每只大鼠僅測量1次，1只大鼠測量后更換清潔水以防上只大鼠氣味干擾，再進行下只大鼠測量。每只大鼠連續測量7 d，取最后3 d均值進行統計分析。

2.6 Western blot法測定海馬組織BDNF含量

大鼠末次行為學測定24 h后，待大鼠麻醉迅速心臟取血，脫頸處死后將大鼠置于冰臺上，分離取出海馬組織。每100 mg海馬組織中加入500 μL的RIPA裂解液(含30 ul蛋白酶抑制劑)，用無菌的眼科剪充分剪碎組織后，冰浴環境下用超聲細胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解20 min；4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液。使用Western blot法測定大鼠海馬組織BDNF含量。

2.7 胸主動脈及大腦中動脈HE染色

大鼠取出海馬組織后，迅速分離出胸主動脈及大腦中動脈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，采用HE染色法處理，顯微鏡攝片。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 胸主動脈及大腦中動脈病理學改變

圖1、2顯示，HE染色及顯微鏡攝片顯示，空白對照組胸主動脈及大腦中動脈血管壁結構未見明顯異常；抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂模型組可見病理性內膜中膜增厚，少許脂質沉積，外膜部分細胞空泡變性，未見明顯脂質斑塊；抑郁高脂GXII組可見內膜中膜少許增厚，提示GXII對心腦動脈可能具有抗動脈粥樣硬化的保護作用。

3.2 曠場實驗和強迫游泳實驗結果

表1顯示，與空白對照組比較，抑郁模型組、抑郁高脂模型組的大鼠曠場實驗活動總距離縮短及強迫游泳不動時間增加(P<0.05)，提示抑郁造模成功。與抑郁模型組比較，抑郁氟西汀組、抑郁GXII組的大鼠曠場實驗活動總距離增加及強迫游泳不動時間縮短(P<0.05)；與抑郁高脂模型組比較，抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組的曠場實驗活動總距離增加及強迫游泳不動時間縮短(P<0.01，P<0.05)，提示鹽酸氟西汀及GXII具有抗抑郁樣作用。抑郁氟西汀組和抑郁GXII組、抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂GXII組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示鹽酸氟西汀和GXII抗抑郁作用療效比較差異無統計學意義。

注：A.空白對照組；B.抑郁高脂模型組；C.抑郁高脂氟西汀組；D.抑郁高脂GXII組圖1 各組大鼠胸主動脈病理形態學變化比較(HE ×400)

注：A.空白對照組；B.抑郁高脂模型組；C.抑郁高脂氟西汀組；D.抑郁高脂GXII組圖2 各組大鼠大腦中動脈病理形態學變化比較(HE ×400)

表1 冠心II號方對大鼠曠場實驗、強迫游泳實驗和BDNF表達影響比較

注：與空白對照組比較：#P<0.05，##P<0.01；與抑郁模型組比較：+P<0.05，++P<0.01；與抑郁高脂模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3 海馬BDNF含量變化

表1顯示，與空白對照組比較，抑郁模型組、抑郁高脂模型組的海馬BDNF含量減少(P<0.01)，提示抑郁造模成功。與抑郁模型組比較，抑郁氟西汀組、抑郁GXII組的海馬BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)；與抑郁高脂模型組比較，抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組的海馬BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)，提示鹽酸氟西汀及GXII具有上調海馬BDNF表達的作用。抑郁氟西汀組和抑郁GXII組、抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂GXII組比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示鹽酸氟西汀和GXII抗抑郁作用療效比較差異無統計學意義。

4 討論

早在東漢時期，著名醫家華佗在《青囊秘錄》中說：“善醫者，必先醫其心，而后醫其身，其次則醫其病。”近些年“雙心醫學”的發展[4]，使醫務工作者對身心疾病的認識進一步提高，CHD合并抑郁癥患者的治療得到醫務界廣泛關注。這種“雙心醫學”的模式體現，是“以人為本”即從“治病”到“治病人”。

GXII是郭士魁大師、陳可冀院士于上個世紀60年代提出的中藥復方，具有活血化瘀之功效，用于治療CHD[6]。此方由中藥丹參、川芍、赤芍、紅花和降香5味傳統中藥按照2∶1∶1∶1∶1比例組成，現有中成藥制劑，包括精制冠心片、精制冠心顆粒、精制冠心軟膠囊和膠囊等，被收錄于《中華人民共和國藥典》。國內研究證明，GXII對CHD具有確切的臨床治療效果[5]，可改善血液流變性及微循環，抑制血小板積聚，預防血栓形成，降血脂和抗動脈粥樣硬化，提高耐缺氧能力，抗心肌梗死、心肌細胞凋亡、抗氧化、增加冠脈血流量、抗炎等諸多作用[5-9]。

本研究大鼠胸主動脈及大腦中動脈病理學改變表明，抑郁高脂GXII組能改善胸主動脈及大腦中動脈病理改變，提示GXII對心腦動脈可能具有抗動脈粥樣硬化的保護作用。該結論與上述GXII心臟保護作用相一致[5-9]。本研究大鼠行為學檢測表明，GXII能增加曠場實驗活動總距離，縮短強迫游泳不動時間，提示GXII具有抗抑郁樣作用。

神經營養學說是目前抑郁癥機制研究的重要學說之一。BDNF在神經細胞的再生、存活、分化、功能維持和突觸的傳遞、重塑性方面發揮著重要作用[10-11]。文獻報道，BDNF與大腦記憶和學習功能密切相關，其機制可能與BDNF廣泛分布于海馬及皮層組織有關[12]。此外，BDNF表達與CHD也相關，研究表明CHD患者血清中BDNF水平升高[13]。BDNF與血管內皮細胞存活、增殖、移行密切相關，并在動脈粥樣硬化、缺血性心肌病等疾病中表達改變。BDNF表達缺陷會導致血管內皮細胞間信號傳導異常及心肌血管內皮細胞凋亡[14]。這些研究提示，BDNF可能在抗抑郁及心臟保護中扮演重要角色。本研究大鼠海馬BDNF表達測定表明，GXII可提高CUMS聯合高脂大鼠模型海馬組織BDNF表達水平，提示GXII具有抗心腦動脈粥樣硬化及抗抑郁樣作用，其作用可能與上調海馬組織BDNF表達相關。

中醫學認為，“胸痹心痛”與“郁病”二者之間有聯系。中醫整體觀認為，形是人的形體，神是人的精神意識思維活動，神形合二為一構建人體。CHD合并心境低落乃是情志與臟腑功能活動失調，即“形神失和”。中醫藏象學說認為，腦為元神之府，心腦共主神明，即心腦血脈相通，共為神明之府，共同主宰人體生命活動，產生意識思維并支配其相應行為。《黃帝內經》提出心主血脈，心藏神。一方面，心臟搏動推動血液流注全身，濡養人體五臟六腑形體官竅；另一方面，心為君主之官，神明出焉，即心主宰人體精神意識思維活動。因心腦共為神明之府，又有血脈相通，故“一處神明傷，則兩處俱傷”。腦之神明傷可累及于心，心之神明傷可累及于腦。中醫病因病機的認識，中醫學對“胸痹心痛”的認識是因年老體虛、飲食不當、情志失調、寒邪內蘊等多種原因導致心脈痹阻、氣滯血瘀，其病位在心，病機為氣滯血瘀。而郁病多由情志內傷引起，其病機主要以氣機郁滯為主常兼血瘀，二者共同的病機為“氣滯血瘀”。王階等[3]對CHD合并抑郁癥進行了相關中醫證候特征研究，并提出CHD合并抑郁癥的中醫證候要素特點為血瘀、氣虛、肝郁、氣滯、痰濁等，其中“氣滯血瘀”被提到重要地位。綜上，“心腦共主神明”學說及“胸痹心痛”“郁病”二者共同的病機皆為氣滯血瘀，這些構建了“腦心同治”的中醫學治療原則，即CHD合并抑郁癥有共同的病理變化基礎，因此“行氣活血”是中醫治療“胸痹心痛”與“郁病”共同的指導原則[15]。GXII作為活血化瘀療法的代表方藥，一方面對“胸痹心痛”患者通過活血化瘀、通絡止痛以達成祛瘀通脈、行氣止痛之效，另一方面對“郁病”患者通過活血化瘀、理氣解郁以達成行氣開郁之效。心腦血脈相通共為神明之府，運用活血化瘀經典中藥復方GXII同時治療“胸痹心痛”及“郁病”，體現了中醫學“腦心同治”的治療原則。

綜上所述，本研究發現GXII具備抗心腦動脈粥樣硬化樣保護作用及抗抑郁樣作用，其作用機制可能與上調海馬組織BDNF表達相關。本研究體現了中醫學“腦心同治”，可能為治療抑郁癥合并CHD患者提供臨床用藥參考。但其具體作用通路、作用途徑仍不明確，尚需今后進一步的深入研究。