加味不忘散對阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經元細胞凋亡及炎癥反應的影響?

李曉瓊，何玲玲，劉曉蕾，李新毅

(山西醫科大學附屬醫院，太原 030032)

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種不可逆的進行性神經系統退行性疾病，約占老年癡呆的50%～75%，臨床癥狀主要表現為記憶認知功能的進行性減退或伴有人格和情感控制等方面的損害[1]，其病理特征主要包括β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的淀粉樣斑塊即老年斑，以及tau蛋白過度磷酸化導致的神經元纖維纏結、神經元不同程度的丟失和膠質細胞活化造成的炎癥介質釋放[2]。目前AD發病機制仍未明確，近年來越來越多的研究發現，Aβ沉積誘導的炎癥反應參與AD發生發展[3]。據國際阿爾茨海默病協會(ADI)2016年公布的數據，全世界有4.7×107例癡呆患者，預計到2050年這一數字將增加到1.31×108以上[4]。目前國內AD患者人數已高達800萬人之多,這為人類帶來沉重的經濟和社會負擔[5]，因此阿爾茨海默病的防治已成為全世界關注的熱點。本課題組先前研究提示，加味不忘散可以改善AD大鼠學習記憶能力。本次研究在之前研究基礎上探討其對AD模型大鼠海馬神經元細胞凋亡及炎癥反應的影響及其發揮作用的可能機制，為中藥治療AD患者提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取8周雄性SD大鼠30只，體質量(275±25)g，由中國軍事醫學科學院實驗中心提供。環境溫度為21±1 ℃，濕度適宜，每天12 h光照/12 h 黑暗，自由進食進水。

實驗動物隨機分為假手術組、模型組、低劑量及高劑量組4組，各組大鼠數量分別為7、8、7、8只。低劑量及高劑量組分別給予低濃度及高濃度加味不忘散，而假手術組、模型組給予蒸餾水。4組大鼠均灌胃給藥(每日1次，1 ml/100 g)，連續給藥20 d。本次實驗已通過山西醫科大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 實驗藥物

加味不忘散組成：遠志20 g，人參、熟地黃各15 g，茯神、當歸、白術各10 g，石菖蒲、黃連各5 g，共計100 g(具體劑量基于徐淑云編寫的《藥理實驗方法學》[6])，制成免煎顆粒共22 g。加味不忘散溶液：加味不忘散低濃度 0.15 g/ml(3.67 g免煎顆粒+111 ml煮沸的水)和高濃度0.30 g/ml(7.33 g免煎顆粒+111 ml煮沸的水)。

1.3 主要試劑

Aβ1-42：濃度2 μg/μL，美國Sigma-Aldrich公司；TUNEL 凋亡檢測試劑盒：美國Merck-Calbiochem；ELISA試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司。

1.4 動物模型制備及驗證

模型組：將大鼠用10% 水合氯醛麻醉，固定于立體定位儀；用碘伏棉球消毒手術區，在大鼠頭頂中間部皮膚作一縱切口，剝離皮下組織，用10% H2O2清潔顱骨表面的肌肉和筋膜并剝離，用顱骨鉆雙側顱骨鉆孔，定位前囟后3.84 mm，旁開2.2 mm，顱骨下2.5 mm(參考包新民等編寫的《大鼠腦立體定位圖譜》)[7]，雙側海馬緩慢注射Aβ1-42(2.5 μl/側)，注射完成留針5 min后局部清潔消毒縫合頭項皮膚，傷口局部注射適量慶大霉素以預防感染；假手術組：除雙側海馬注射等量生理鹽水外，余與模型組相同。

模型驗證：造模14 d后進行Morris水迷宮實驗驗證，大鼠學習記憶功能減退者即為造模成功，之后對造模成功的模型組大鼠連續灌胃給藥20 d。

1.5 觀察海馬組織結構及海馬神經元凋亡情況

灌胃結束后用10%水合氯醛麻醉大鼠，用4%多聚甲醛經心臟灌注，于冰塊上迅速取出海馬后進行石蠟包埋，分別用HE染色、TUNEL觀察海馬組織結構及海馬神經元細胞凋亡情況。

1.6 檢測血清及海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量

血清采集：使用采血針刺入左室心尖處搜集；海馬組織：用10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦后迅速分離雙側海馬制備海馬勻漿，根據ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織形態學改變

圖1顯示，假手術組海馬神經元細胞形態正常，結構完整，排列整齊，未見到壞死的神經元；模型組海馬神經元細胞可見形態異常，結構疏松，排列紊亂，可觀察到胞核固縮；低劑量組和高劑量組海馬神經元細胞較模型組均有不同程度改善。

注：A.假手術組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組圖1 各組大鼠海馬組織HE染色比較(×400)

2.2 各組大鼠海馬神經元細胞凋亡比較

表1圖2顯示，假手術組海馬組織內凋亡細胞(即TUNEL染色陽性細胞)數極少，模型組較假手術組相比可見到大量的凋亡細胞(P<0.0001)，低劑量組與模型組相比未見凋亡細胞數減少(P>1.0)，高劑量組較模型組凋亡細胞數減少(P=0.01)，而低劑量組凋亡細胞數未見明顯差異(P=0.12)。提示Aβ1-42可導致海馬神經元細胞凋亡，低濃度加味不忘散未能改善海馬神經元凋亡情況，高濃度加味不忘散可以在一定程度上改善Aβ1-42所致的海馬神經元凋亡。

2.3 各組大鼠血清及海馬組織炎癥因子水平比較

表1顯示，4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示加味不忘散并不影響血清炎癥因子水平。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平、海馬TUNEL陽性率及炎癥因子水平比較

注:與假手術組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01;與低劑量組比較:△P<0.05

注：A.假手術組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組圖2 各組大鼠海馬組織TUNEL染色比較(×100)

表1顯示，海馬組織中IL-1β模型組較假手術組水平增加(P<0.0001)，低劑量組較模型組比較并未降低(P=0.80)，高劑量組較模型組水平降低(P<0.0001)，高劑量組較低劑量組水平降低(P=0.01)；海馬組織中IL-6模型組較假手術組水平增加(P<0.0001)，低劑量組較模型組比較并未降低(P=0.60)，高劑量組較模型組水平降低(P=0.001)，高劑量組與低劑量組比較未降低(P=0.24)；海馬組織中TNF-α模型組比較假手術組水平增加(P<0.0001)，低劑量組、高劑量組較模型組水平降低(P=0.02，P<0.0001)，高劑量組較低劑量組相比未減少(P=0.23)。提示Aβ1-42增加了海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，而低濃度加味不忘散能夠降低TNF-α水平，但未能降低IL-1β及IL-6水平，高濃度加味不忘散可以減弱Aβ1-42所致的IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加。

3 討論

AD作為老年癡呆最常見的原因，其發病與年齡相關，隱匿起病，病程發展緩慢且不可逆，臨床主要表現為近記憶力損害[4]。目前AD病因機制不明，主要包括Aβ神經毒性學說、tau蛋白學說、中樞膽堿能機制及越來越受到重視的神經炎癥機制[4]。AD屬于中醫學“呆病”范疇[8]，其中腎虛腦髓失養是其基本病機[9]。目前FDA用于批準治療AD的藥物僅能改善患者的生存質量，對AD病程的進展及患者的長期預后并無顯著影響。近年來，針對AD主要病理特征Aβ及tau蛋白免疫治療因其不可避免的副作用尚未達到預期效果[10]。

結合現代中醫藥理論基礎以及AD相關基礎研究，中藥在AD治療方面的優勢為防治AD提供了一個新的思路。有研究表明，中藥單體姜黃素、丹參素及何首烏等[11]以及中藥復方開心散、腦靈湯等[12]在AD臨床治療方面確實存在一定療效，因此關于中藥治療AD的研究受到人們來越多的關注。

有研究發現，古方不忘散可以改善雌激素缺乏AD大鼠模型認知功能損害，并降低海馬組織炎癥反應[13]。加味不忘散是在不忘散基礎上增加熟地黃、當歸、白術、黃連4味中藥而成，組方較前更加科學合理。本課題組前期研究已發現，加味不忘散可以改善AD模型大鼠學習記憶功能，說明加味不忘散的神經保護作用[14]。

神經元細胞大量丟失是AD典型的病理特征之一，神經元丟失是以細胞凋亡形式出現[15]。有研究發現，Aβ能夠誘導腦內神經元細胞凋亡[16]，然而其具體機制仍未明確。此外，神經炎癥反應同樣在AD的發生發展中發揮重要作用，尤其是在疾病早期階段，膠質細胞活化啟動的惡性循環會促使炎癥因子釋放和神經元損害[17]。盡管有些臨床研究顯示AD患者癥狀略有改善，但非甾體抗炎藥的療效在總體上并不樂觀[18]。近年來，中藥復方的基礎研究[19]體現出中藥在抗AD神經炎癥反應方面的優勢。

本次實驗結果顯示，模型組海馬神經元凋亡及炎癥反應較其他組嚴重，低、高劑量組海馬神經元凋亡數量較其余3組有改善，高劑量組同樣可以減少Aβ1-42所致的IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，而低劑量組上述作用不明顯。這可能是因為Aβ1-42誘導神經元凋亡及神經炎癥反應發生，同時高濃度加味不忘散對神經元凋亡及神經炎癥反應有效。在本次實驗中尚未對AD模型大鼠神經炎癥指標與AD病理學標志物(如Aβ)之間的關系進行探討，在以后的研究中將會進一步探索加味不忘散對AD大鼠神經炎癥相關通路及其與AD典型病理學標志物關系的影響，以期為AD的治療提供一個新的策略。

綜上所述，加味不忘散可以抑制Aβ1-42誘導AD大鼠模型海馬炎癥因子釋放及神經元細胞凋亡，提示加味不忘散可能通過抑制炎癥反應發揮其神經元保護作用。