非洲紫羅蘭花梗高頻再生體系的建立

李 鶯，張玉姣、瞿亞梅、屈 雯、楊帥帆

(西安文理學院 生物與環境工程學院，秦嶺野生觀賞植物研究中心，陜西 西安 710065)

非洲紫羅蘭(SaintpauliaionanthaWendl)又名非洲苦苣苔，系苦苣苔科多年生常綠宿根草本花卉。非洲紫羅蘭品種繁多，其株型小巧，花色多種多樣，一年開花3～4次，是深受大眾喜愛的觀賞花卉之一，非洲紫羅蘭一般在人工栽培條件下，授粉率結實率很低，不易得到種子，且其繁殖周期長，不能滿足市場的大量需求，因此，采用組培快繁是解決其繁殖的有效途徑之一[1]。

目前，有關非洲紫羅蘭的研究主要集中于組織培養、生理生化、花色機理、栽培管理和轉基因技術等方面。我國從20世紀80年代到現在一直在開展非洲紫羅蘭的組織培養及工廠化育苗的研究工作，但主要集中在以其葉片為外植體進行離體培養[2]，而采用花梗進行離體培養方面的研究未見報道，因此我們在前人研究的基礎上，采用花梗為外植體進行離體組織培養，以期獲得高頻的再生體系。

1 材料與方法

材料引自陜西省西安市朱雀花卉市場，品種'Diana'。

1.1 外植體的消毒與培養

選取適量非洲紫羅蘭的總花梗作為外植體置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗3h，轉移至超凈工作臺。先在70%乙醇中浸泡10s，無菌水中沖洗2次，然后用2%的次氯酸鈉溶液滅菌5 min，再用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙將消毒完成的外植體上的殘留液體吸干。花梗切成0.5～1 cm左右的小段，接種后將培養皿放置在PQX-330A-22H多段人工氣候培養箱內培養，光照12 h·d-1，光照強度40～50 mol m-2s-1，光照培養溫度為25±1℃，暗培養溫度為18±1℃，培養濕度為60%。

1.2 初代培養

將微量元素中的硫酸錳減少到1/4的改良MS作為為基本培養基，將已消毒的花梗切成小段接種在以下四種培養基中：① 改良的MS+1.0 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1IBA(以下單位相同)；② 改良MS+6-BA2.0+ IBA0.2；③ 改良MS+6-BA1.0 +NAA0.1；④ 改良MS+6-BA2.0+NAA0.2。每組培養基接種6個培養皿， 每個培養皿接種4～6個小段，觀察并統計出愈率。

出愈率=(誘導出愈傷組織外植體數/接種外植體數)×100%

1.3 繼代培養

將誘導出愈傷組織的外植體進行繼代培養，在③號改良MS+ 6-BA1.0 + NAA 0.1培養基，上進行不定芽的誘導及增殖培養，觀察并統計出芽率及增殖系數。出芽率=(誘導出不定芽外植體數/接種外植體數)×100%，增殖系數=繼代后的芽苗數/繼代前的芽苗數。

1.4 生根培養

將已長出4片及以上真葉的不定芽挑出接種在以下生根培養基中：⑤ MS+ NAA0.1；⑥ MS+ NAA0.5；⑦ MS+NAA0.5+ IAA0.5，觀察并統計生根率。

生根率=(生根的外植體數/接種外植體數)×100%

1.5 煉苗移栽

選取生長健壯、生根良好的試管苗，打開瓶蓋，煉苗3～5 d。移栽于草炭和蛭石1：1的基質上，統計其成活率。

2 結果與分析

2.1 初代培養

將總花梗分別接種到四組培養基中培養，30 d觀察到花梗誘導出少量愈傷組織，愈傷組織緊密，黃綠色，60 d統計結果見表1。

表1 不同激素配比對花梗誘導愈傷組織的影響

30 d，四組培養基中總花梗均誘導出少量愈傷組織，其中③號最先出現緊密型愈傷組織。60 d觀察，①號培養基內僅有少量水浸狀愈傷組織且有輕微褐化，如圖1-a；②號培養基內愈傷組織不明顯，大部分褐化，如圖1-b；③號培養基內所有花梗均誘導出淺綠色緊密型愈傷組織，即出愈率100%，且愈傷組織形態飽滿充盈，沒有褐化現象，如圖1-c；④號培養基內僅有少量愈傷組織，但已有芽分化，部分外植體完全褐化，誘導出少量愈傷組織后均分化出不定芽，所以出愈率和出芽率均為77.8%，如圖1-d。

實驗表明：③號培養基是總花梗誘導愈傷組織的最適培養基，④號培養基是總花梗快速誘導芽分化的較適培養基。

2.2 繼代培養

將總花梗誘導出的愈傷組織轉移至③號即改良的MS+6-BA1.0+NAA0.1上進行繼代培養。30 d觀察，所有的繼代的愈傷組織均分化出不定芽，出芽率高達100%，且每塊愈傷組織平均分化5～6個芽，60 d則觀察每塊可高達50～60個芽，增殖系數近10倍，增殖的不定芽葉片極小，如圖1-e.f。因此，改良的MS+6-BA1.0+NAA0.1是優質的芽增殖培養基。

2.3 生根培養

將繼代增殖培養產生不定芽小苗接種到3種生根培養基中誘導生根。30 d統計結果見表2。

表2 不同濃度植物生長調節劑生根的影響

30 d時，三組培養基內的所有不定芽均已生根。其中⑤號培養基，不定芽明顯增高，較纖細，葉片微卷，基部少量褐化，根濃密較短；⑥號培養基中，不定芽植株矮小，葉片形狀不規則，大葉極大，小葉極小，根濃密較短，⑦號培養基中，植株矮小，基部少量褐化，根毛濃密。由表4可看出，三組培養基均能誘導不定芽生根，因此， NAA在0.1～0.5 mg·L-1范圍內均適宜誘導生根。

2.4 煉苗移栽

選擇生長一致的試管苗，移栽于草炭和蛭石1:1的基質上,60 d后統計其成活率高達95.33%，見圖1-h。

3 討論與結論

多數關于非洲紫羅蘭的組織培養實驗中都選擇了葉片作為外植體,幼嫩葉片是優良的外植體[1]。例如黃靖[3]在使用葉片和莖段作為外植體誘導愈傷組織時，35 d葉片誘導率為100%，而莖段為0%；吳麗芳[4]等人的研究表明，70 d葉片的誘導率達64.7%，葉柄的誘導率僅有8.4%，而以其花梗為外植體進行組織培養的研究未見報道，本實驗在前人研究的基礎上采用總花梗作為外植體進行組織培養研究，實驗結果表明：非洲紫羅蘭的總花梗也是一種適合于組培快繁的外植體。

圖版1非洲紫羅蘭花梗組織培養

a.①號培養基誘導愈傷組織；b.②號培養基誘導導愈傷組織；c.③號培養基誘導導愈傷組織；d.④號培養基誘導愈傷組織和不定芽； e增殖培養1; f增殖培養 2; g誘導不定芽生根 h煉苗移栽的試管苗

初代培養中所使用的四組培養基中，通過比較①、③組和②、④組，在6-BA濃度相同的情況下，6-BA與NAA配比出愈率高于6-BA 與IBA配比，說明6-BA與NAA的配比組合是最適宜的。這與張曉軍[5]等人的實驗表明6-BA與NAA的搭配優于KT與NAA的搭配及ZT與NAA的搭配，即6-BA與NAA配比組合是最適宜的觀點一致。而比較①、②組和③、④組，隨著6-BA濃度由1 mg·L-1增加到2 mg·L-1時，NAA或IBA由0.1 mg·L-1增加到2 mg·L-1時，愈傷組織誘導率反而下降，說明， 6-BA1.0 mg·L-1與NAA0.1 mg·L-1為誘導愈傷組織的最適配比，與黃靖[3]、趙興兵[6]、耿明清[7]等人的結論一致。

總之，非洲紫羅蘭的花梗是理想的外植體。改良的MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養基既適宜初代培養又適宜繼代培養，初代培養出愈率高達100%，繼代培養中可再分化不定芽，出芽率100%，在改良的MS+ NAA0.1-0.5 mg·L-1范圍均可誘導生根，生根率100%，試管苗移栽到草炭和蛭石1:1的基質上成活率高達95.33%。