巨桉BRI1基因的克隆和表達分析

李曉丹, 胡冰, 裘珍飛, 范春節, 閆慧芳, 曾炳山

巨桉基因的克隆和表達分析

李曉丹, 胡冰, 裘珍飛, 范春節, 閆慧芳, 曾炳山*

(中國林業科學研究院熱帶林業研究所，廣州 510520)

為了解基因在巨桉中的功能，采用PCR技術克隆了基因，分析了EgrBRI1的生物信息學和亞細胞定位，并對基因響應激素和脅迫的差異表達進行了分析。結果表明，基因全長3 893 bp，編碼1 197個氨基酸。EgrBRI1蛋白穩定，空間結構復雜，存在3個motifs，主要定位于細胞膜。茉莉酸甲酯和油菜素內酯(BR)處理后，基因在葉片中的表達上升，而水楊酸處理則沒有明顯的變化。鹽脅迫和冷脅迫下，基因表達表現為先下降后上升的趨勢。因此，基因能快速對外施激素做出響應，并在巨桉抗逆方面發揮重要作用，這可能是通過對BR信號的響應來實現的。

巨桉; 油菜素內酯;基因; 基因表達

油菜素內酯(brassinolides, BR)是一種新型的植物激素，二十世紀70年代在油菜()花粉中發現。BR在植物中含量較少, 但活性極高[1]，且適用性廣、無毒，多存在于植物的生殖器官和營養器官中[2]。BR能調控植物細胞伸長和分化、維管組織分化、衰老、開花時間[3]、雄性育性、花粉發育、種子大小、光形態建成等一系列植物生長發育過程以及應對生物和非生物脅迫等過程[4–5]。對油菜幼苗外施BR能促進其體內熱休克蛋白的積累，顯著增強耐熱性[6]；對大麥()施用BR能減少赤霉病危害，降低產量損失[7]。而BR缺失突變體或不敏感型突變體則會出現矮化、維管組織發育不正常、墨綠色葉、開花和衰老延遲、雄性不育、種子萌發率降低及黑暗條件下去黃化等表型[8]。

在BR信號轉導途徑中，基因(brassinosteroid insensitive 1)編碼1個亮氨酸受體激酶, BRI1定位在細胞膜上，通過胞外的結構域感受BR信號，啟動胞內的激酶活性，使得抑制因子BKI1 (BRI1 kinase inhibitor 1)從BRI1上解離[9]，BKI1的解離促使BRI1與其共受體BAK1/SERK3 (BRI1-associated kinase 1/ somatic embryogenesis receptor-like kinase 3)相互作用[10]，接著通過一系列的激酶和磷酸酶的順序作用，繼續向下傳遞BR信號。BR信號通路中的關鍵轉錄因子BZR1 (brassinazole-resistant 1)和BES1 (BRI1- EMS-suppressor 1)從而被去磷酸化, 進入細胞核內調控BR相關基因的表達[11]。BRI1是1個細胞膜上的富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats, LRRs)的類受體激酶，目前已發現20多個BRI1的突變體，都表現出葉片變圓、育性下降、衰老延遲等BR缺陷的典型特點[12]。

桉樹()又稱尤加利樹，是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬植物的統稱。桉樹原產地位于澳大利亞，近幾十年來已經成為全球人工林最重要的造林樹種之一[13]。桉樹木材質量優良，是用來做家具和裝飾的理想材料。改良桉樹材性，不僅有利于我國森林資源的合理利用，而且可促進國內木材加工工業的持續發展[14]。巨桉()全基因組測序的完成，也為開展基因克隆和鑒定相關基因功能提供了寬廣的基礎平臺[15]。

BR信號需被BRI1蛋白感應才能啟動一系列的信號級聯傳遞，鑒于BRI1在BR信號轉導途徑中扮演的重要作用，本研究以巨桉材料，克隆了基因，采用實時熒光定量PCR對其在高鹽、低溫脅迫和BR、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)處理后的表達模式進行分析，同時還構建了亞細胞定位載體，觀察巨桉BRI1蛋白在細胞內的表達情況，另外還構建了超表達載體，對其進行功能鑒定，為探討桉樹次生維管發育的分子調控機理和分子育種提供基礎研究數據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為巨桉()無性系GL1，由中國林業科學研究院熱帶林業研究所林木生物技術組培育。選擇生長狀況良好，高度為30~ 40 cm的幼苗。

大腸桿菌() Trans1-T1感受態細胞、TA克隆載體購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自美國的英濰捷基公司；PCR高保真酶和PCR Mix購于美國紐英倫生物技術；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNaseI試劑盒購自德國凱捷(Qiagen)公司；DNA Marker購自上海捷瑞生物技術公司。引物合成和DNA測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 EgrBRI1基因克隆和生物信息學分析

總RNA的提取和cDNA的合成 使用EASY- spin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取總RNA,采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測質量，OD260/OD280為1.8~2.0，28S/18S約為2的RNA樣品進行cDNA的合成。采用Invitrogen Superscript III，按照操作步驟獲得cDNA產物并置于–20℃冰箱保存。

基因克隆 利用DNAMAN軟件設計克隆基因的引物(表1)。以cDNA為模板采用Q5 High-Fidelity PCR Kit進行PCR反應，采用20L反應體系，其中退火溫度為62℃，35個循環。PCR產物采用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)進行目的片段回收。

生物信息學分析和進化樹的構建 將巨桉基因序列提交NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/WebSub/?tool=genbank), 登錄號為KP721492。通過ExPASy數據庫中的在線分析軟件ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)分析EgrBRI1蛋白的理化性質[16]，利用RasMol/PyMOL軟件對EgrBRI1蛋白的結構進行分析。使用在線軟件WoLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位預測[17]。在NCBI的BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找不同植物的同源序列，選擇相似度較高的物種，與巨桉EgrBRI1氨基酸序列進行多序列比對，在MEGA 6.0軟件中構建進化樹, 進化樹以Gblock多重比對下的平均距離樹(average distance tree)表示。

1.3 載體構建及亞細胞定位

載體構建 回收的目的片段連接于pEASY- Blunt克隆載體，熱激法轉化。通過菌液PCR檢測,由上海生工生物工程有限公司進行測序確認。采用Gateway法將目的基因構建到pMDC32載體上，使用電擊轉化法，將載體轉化根癌農桿菌() GV3101。采取同樣方法構建亞細胞定位載體，轉化農桿菌GV3101。

表1 文中所用引物

亞細胞定位 采用基因槍介導轉化法，將構建好的亞細胞定位載體，通過基因槍法導入洋蔥()表皮細胞，采用熒光顯微鏡檢測該基因在細胞內的瞬時定位表達情況。具體步驟如下: 首先將金粉消毒，然后與DNA包埋，取50L金粉懸浮液，加入5L (1gL–1) DNA+50L (2. 5 mol L–1) CaCl2+20L (0.1 mol L–1)亞精胺充分混勻渦旋, 9 391×離心30 s后倒掉上清液，然后加入250L預冷的無水乙醇，渦旋1~2 min；15 871×離心1 min后倒掉上清，用60L無水乙醇重懸沉淀物。

同時選取新鮮洋蔥，剝去外層，用解剖刀切取第2~3層鱗莖，切成3 cm×3 cm方塊。用鑷子小心撕下內表皮，將其置于高滲MS培養基中室溫培養2~4 h。選用900 psi的可裂膜，將10L微彈懸浮液置于轟擊膜中央，待風干后進行轟擊。采用PDS1000/He 型基因槍轟擊，轟擊微粒運行距離為9/12 cm各1次，可裂膜與載體膜之間的距離為2.5 cm，載體與阻擋網之間的距離為0.8 cm，真空度為26~28 In·Hg。將轟擊后洋蔥表皮細胞在高滲MS培養基上培養16~20 h后，轉移到MS培養基上培養24 h后制片，置于倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axio Obrserver A1)下觀察。

1.4 EgrBRI1基因的差異表達

用0.1 mmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)、0.2mol L–1BR、0.1 mmol L–1水楊酸(SA)噴施處理，分別在0、1、6、24和168 h后取葉片；參考姚海榮等[18]的方法進行鹽處理和冷處理，200 mmol L–1NaCl分別處理0、1、6、24和168 h后取葉片；冷處理為在4℃下分別培養0、2、4、24和48 h后取葉片。樣品采集后立即放入液氮內，然后轉入-80℃冰箱中保存備用。基因的表達分析使用Roche公司的Light Cycler96熒光定量分析儀，采用SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)試劑盒進行分析。cDNA樣品稀釋25倍, 程序為95℃ 30 s→(95℃ 5 s→60℃ 34 s) 40個循環, 溶解曲線程序為95℃15 s→60℃1 min→ 95℃ 15 s。內參基因為。

2 結果和分析

2.1 EgrBRI1基因克隆和生物信息學分析

利用設計好的特異性引物(表1)對基因進行PCR擴增，擴增產物經電泳檢測后，回收目的片段并測序，片段長度為3 893 bp (圖1)。

切取目的片段凝膠回收基因片段，然后將回收產物連接于克隆載體，經過篩選、PCR擴增、測序分析和比對，證實獲得基因的核苷酸序列。經過氨基酸預測分析，基因編碼1 197個氨基酸序列，其分子量為129 690.6 kD,理論等電點為6.01，不穩定系數為35.4，EgrBRI1蛋白質結構穩定，存在信號肽。脂肪系數97.37, 屬于親水性蛋白。蛋白質二級結構分析發現，-螺旋占35%，-轉角占8.69%，延展結構為17.71%，無規卷曲占38.6%。蛋白無序性分析表明，EgrBRI1蛋白質不規則區域數為7，無序化分值為0.202。亞細胞定位預測該蛋白定位于細胞膜上，存在跨膜區，存在長度為141個殘基的結構域，共有3個motifs, 含有LRRNT_2 domain、LRR_1 domain、LRR_8domain以及Pkinase domain (圖2)。

圖1 EgrBRI1基因的擴增

通過NCBI中的BLAST程序對EgrBRI1蛋白與其它植物中BRI1蛋白進行同源性分析(圖3)，結果表明EgrBRI1與擬南芥()、大豆()、蓖麻()、毛果楊()、可可()中的BRI1蛋白同源性高達77.60%，且都具有保守的3個LRR序列，說明BRI1在植物中高度保守。同時發現巨桉與楊樹和蓖麻的親緣關系最近，與其他植物遺傳距離較遠(圖3)。

2.2 載體構建和亞細胞定位

以克隆載體為模板，經過BP反應將基因構建到入門載體pDONR221中，然后通過LR反應將基因構建到超表達載體pMDC32上, 該載體轉化進入農桿菌GV3101細胞，菌液PCR檢測證實基因的超表達載體已轉化到農桿菌菌株中(圖4)。

亞細胞定位載體構建同樣使用Gateway克隆法,模板為上一步中的克隆載體, BP反應將目的基因交換到入門載體pDONR207上，LR反應后將基因構建到表達載體pEarly101中，檢測目的載體是否成功進入農桿菌GV3101體內，使用35S引物和克隆引物(表1)，農桿菌菌液PCR檢測，結果如圖5所示，得到/pEarly101-GV3101菌株, 亞細胞定位載體構建工作完成。

將構建好的EgrBRI1亞細胞定位載體EgrBRI1/ pEarly101-GV3101與pEarly101-GV3101空白載體，利用基因槍法轉化進入洋蔥表皮細胞，得到EgrBRI1蛋白在洋蔥表皮細胞內的瞬時表達情況。如圖6所示，空白載體轉化的洋蔥細胞內熒光分布在細胞各個部位，而重組載體轉化的洋蔥表皮細胞內，熒光主要分布在細胞膜上。這說明EgrBRI1蛋白定位于細胞膜上進一步行使其功能。

2.3 激素處理對EgrBRI1基因的差異表達影響

從圖7可以看出，經過MeJA處理的巨桉葉片中基因的表達量升高，尤其是在1 h時表達量急劇升高，約為對照的593倍，說明能夠快速的回應MeJA處理(圖7: A)。與MeJA處理相似，BR處理時，基因的表達量升高，經過168 h處理表達量達到最高，約為對照的2.9倍(圖7: B)。然而，SA處理時EgrBRI1表達量并未出現明顯變化(圖7: B)。這說明基因對不同的激素響應方式不同。

2.4 脅迫處理對EgrBRI1基因的差異表達影響

在鹽處理時，葉片中基因表達量呈現出先高后低的現象，在6 h處理時表達量達到最大，為對照的2.3倍，隨后基因表達量逐漸降低，在168 h處理時其表達量顯著下降，遠低于對照水平(圖8)。而在冷脅迫處理時，基因的表達量呈現出快速應答的表現，在1 h時表達量迅速下降，隨后緩慢上升，但仍然低于對照水平，處理48 h表達量升高，超過對照。這表明基因響應鹽脅迫和冷脅迫的表達方式明顯不同(圖8)。

3 討論

本文成功克隆了巨桉的基因，全長3 893 bp，編碼1 197個氨基酸，與劉明月等[19]克隆的杜仲()基因(無內含子,全長為3 612 bp，編碼1 203個氨基酸)長度上存在差異，可能是不同物種的原因。EgrBRI1蛋白質理化性質穩定，預測其存在細胞膜表面，可以感知BR信號，并與之結合。Wang等[20]報道大豆的GmBRI1蛋白結構穩定，具有激酶活性，且結構高度保守。EgrBRI1蛋白質的生物信息預測結果與其相似，說明EgrBRI1和GmBRI1蛋白質具有親緣性。通過構建亞細胞定位載體，基因槍介導轉化洋蔥細胞，觀察到EgrBRI1蛋白質定位于細胞膜上。這說明BRI1蛋白質在植物中具有高度的保守性，主要在細胞膜上響應BR并行使功能。

圖2 EgrBRI1 氨基酸序列與其他植物的多重比較分析。Egr: 巨桉; At: 擬南芥; Pp: 桃樹; Gm: 大豆; Pt: 毛果楊; Rc: 蓖麻; Cp: 番木瓜; Tc: 可可。LRRNT_2: 富含亮氨酸重復N-末端結構域; LRR_1, LRR_8: 富含亮氨酸重復序列; Pkinase: 亮氨酸激酶結構域。

Fig. 2Multiple comparation analysis ofamino acid sequenceof EgrBRI1 and other plants. Egr:; At:; Pp:; Gm:; Pt:;Rc:; Cp:; Tc:. LRRNT_2 is Leucine rich repeat N-terminal domain; LRR_1, LRR_8 are Leucine rich repeats; Pkinase is Leucine kinase domain.

圖3 EgrBRI1的系統進化樹。Rc: 蓖麻; Gm: 大豆; Cp: 番木瓜; Egr: 巨桉; Tc: 可可; Pt: 毛果楊; At: 擬南芥; Pp: 桃樹。

圖 4 EgrBRI1超表達載體構建檢測

圖5 EgrBRI1亞細胞定位載體構建檢測

圖6 EgrBRI1在洋蔥表皮細胞中的定位。A: BRI1-YFP明場與熒光場疊加; B: BRI1-YFP明場; C: BRI1-YFP熒光場; D: YFP明場與熒光場疊加; E: YFP明場; F: YFP熒光場。

圖7 茉莉酸甲酯(A)、水楊酸(B: SA)、油菜素內酯(B: BR)處理后巨桉葉片中EgrBRI1的相對表達量

圖8 鹽和冷脅迫下巨桉葉片中EgrBRI1的相對表達量

植物的生長發育受植物激素的協同或拮抗作用共同調節，BR作為一種甾醇類新型植物激素參與到植物生長發育過程中，如種子萌發、開花、結實、解除逆境脅迫等。BR與其他植物激素間存在互作，共同調節植物的各個生長發育過程[21]。MeJA處理1 h的表達量是對照的593倍，表明JA與BR具有協同作用。張弦等[22]也報道，MeJA和BR處理能減輕強光對蘋果()葉片的抑制作用。同時對水楊酸的刺激沒有明顯的響應，然而徐曉昀等[23]的研究卻認為，外施水楊酸和BR能增強黃瓜()幼苗對低溫的耐受性。這可能是不同物種的響應機制不同導致的。而外施BR 1 h的表達量略微降低，隨后表達量顯著升高，說明在桉樹中作為BR的受體，能夠明顯響應BR。但在郝嶺等[24]的研究提到，在玉米中過表達基因會恢復突變體的表型, 這是由于修復了突變體信號通路, Wang等[20]的研究也有相似的結論，這進一步證實了的表達受BR的調控。

同時，本研究結果還表明能對鹽脅迫和冷脅迫做出應答。岳健敏等[25]研究提出，鹽脅迫下外源添加BR能提高刺槐()葉片中葉綠體的數量，維持一定的光合作用，增強對鹽脅迫的抗性，但并未對BR相關基因的表達進行研究。而本研究結果表明，鹽處理6 h的表達量有明顯上調，意味著BR對于鹽脅迫的應答可能是通過表達來實現的。而冷脅迫處理48 h表達量為對照的1.6倍，表明能夠響應冷脅迫。而吳進東[26]的研究也提出，BR能夠增強植物抗寒性，主要是通過提高植物葉片抗氧化酶系統的活性。因此，我們推測基因可能通過響應BR來提高桉樹的耐寒性，具體作用機制需要進一步研究。后續我們將構建啟動子載體和超表達載體轉化桉樹，以期獲得相應的轉基因植株，通過表型分析等進一步完善基因的功能鑒定。

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Gene Cloning and Expression Analysis ofin

LI Xiao-dan, HU Bing, QIU Zhen-fei, FAN Chun-jie, YAN Hui-fang, ZENG Bing-shan*

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guagndong,Guangzhou 510520, China)

In order to understand the function ofgene in,gene was cloned, and the bioinformatics and subcellular localization of EgrBRI1 were analysis. Meanwhile, the expression ofgene were analyzed after treated with hormones and stresses by qRT-RCR. The results showed that the length ofgene was 3 893 bp, encoding 1 197 amino acids. EgrBRI1 protein was relatively stable with complex spatial structure, which contains three motifs. EgrBRI1 protein was mainly located in cell membrane. When treated with methyl jasmonate and brassinolide, the expression ofgene in leaves showed an up-regulated trend with the time, while there was no significant change by treated with salicylic acid. Under salt and cold stresses, the expression ofgene was down-regulated at first and then increased with the time. These indicated thatgene could respond quickly to applied hormone and play an important role in stress resistance of, which might be achieved by responding to BR signal.

; Brassinosteroid;gene; Gene expression

10.11926/jtsb.4044

2019–01–21

2019–03–12

國家自然科學基金項目(31400554)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31400554).

李曉丹(1995~ )，女，碩士研究生，專業方向為林木生物技術。E-mail: 924489727@qq.com

Corresponding author. E-mail:b.s.zeng@vip.tom.com